Bir fare modelinde serebral hipoksi-iskeminin neden olduğu beyin hasarının görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Ouyang, Y., et al. Fare Serebral Hipoksi-iskemisi Sırasında Eş Zamanlı PET/MRG Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, eşzamanlı pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI) yoluyla serebral hipoksi hasarını değerlendirmek için bir teknik göstermektedir. Anestezi uygulanmış bir fare, ortak karotis arter (CCA) ligasyonuna tabi tutulur, bu da bir beyin yarım küresine kan akışını azaltır ve onu hipoksiye bağlı yaralanmaya yatkın hale getirir. PET ve MRG görüntüleme, hipoksi sırasında glukoz metabolizmasını ve yapısal değişiklikleri değerlendirir. MRG, kısıtlı su difüzyonunu tespit ederken, PET, hipoksiye bağlı hücresel stresi ve metabolik bozukluğu gösteren azalmış glikoz alımını ortaya çıkarır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tek Taraflı Ortak Karotis Arter (CCA) Ligasyonu

1. : Sterilize edilmiş cerrahi aletler ve uygun şekilde yerleştirilmiş malzemelerle steril alan hazırlayın. Sıcaklık probu pedin üzerine güvenli bir şekilde yerleştirilerek ısıtma yastığının 37 °C'ye ısıtıldığından emin olun. Ameliyat bölgesini kaplamak için steril bir örtü kullandığınızdan emin olun.
2. Hayvanı uyuşturun (izofluran, 0.5-1 L / dk'da havada% 1-3) ve hayvanı kuyruğu uzağa bakacak şekilde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ayak parmağını sıkıştırarak anesteziyi kontrol edin - hayvan uygun şekilde uyuşturulursa bu herhangi bir reaksiyona neden olmamalıdır. Gözlere oftalmik merhem sürün.
3. 1-2 pamuklu çubuk kullanarak boynun alt kısmına ve üst göğüs bölgesine epilasyon kremi sürün. 1-3 dakika bekleyin ve ardından ıslak gazlı bez veya alkollü bezler kullanarak saçları ve kremi çıkarın. Betadine ile kesi alanını içeriden dışarıya dairesel bir şekilde sürüntü ve ardından steril cerrahi eldivenlere dönüştürün.
4. Cerrahi makas kullanarak alt boynun orta hattı boyunca yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın. Cerrahi makas kullanarak dış cildi çevredeki fasyadan dikkatlice ayırın.
5. İki McPherson mikro iris dikiş forseps kullanarak, damarlara zarar vermemeye veya vagus sinirini rahatsız etmemeye özen göstererek sağ ortak karotis arteri fasyadan ayırın.
6. Sağdaki forsepsleri kullanarak, sağ CCA'yı sabit bir pozisyonda dışlayın. Kurumayı önlemek için birkaç damla tuzlu su uygulayın. Sağ CCA'nın altına uygun uzunlukta (2-3 cm) 6-0 ipek sütür geçirin ve çift kare bir düğüm kullanarak bağlayın. İsteğe bağlı olarak, ikinci bir uzunlukta 6-0 ipek sütür kullanarak tekrar ligate edin.
7. Sağ CCA'yı yeniden konumlandırın ve steril bir sünger uçlu çubuk kullanarak fazla sıvıyı açıktan temizleyin. Kesi 6-0 ipek sütür ile kapatın. Lidokaini topikal olarak 7 mg / kg'a kadar uygulayın.
8. Hayvanın ambulatuvar olana kadar (yaklaşık 30 dakika) anesteziden kurtulmasına izin verin ve hayvan görüntüleme için hazır olana kadar cerrahi sonrası izleme yapın.

2. Görüntüleme için Hazırlık: Sistem ve Donanım Kontrolleri

1. MRI ve PET sistemleri için donanım ve yazılım kurun ve işlevlerini aşağıdaki gibi kontrol edin. Tüm fiziksel bağlantıların güvenli olduğundan ve yazılım ayarlarının uygun şekilde seçildiğinden emin olun.
   1. Hava soğutma sistemini kullanarak PET sisteminin öngörülen 5 °C çalışma sıcaklığında olduğundan emin olun.
   2. Bilinen eksenel ofsetleri kullanarak PET ve MRI görüş alanı (FOV) merkezlerini hizalayarak PET sistemini MRI deliğinin içine monte edin. MRI bobinini PET sisteminin deliğinin içine monte edin ve bobini PET sistemi ve MRI mıknatıs merkezleri ile ortalayın.
   3. Güç ve öngerilim voltajı için PET elektroniklerini açın (Not: adımlar cihaza göre değişecektir). 68Ge silindir kullanarak hızlı (5 dakikalık) bir tarama yapın ve tüm dedektörlerin çalışır durumda olduğundan emin olmak için ortaya çıkan sinogramı kontrol edin.
   4. İsteğe bağlı olarak, ortak kayıt amacıyla bir PET / MRI dönüşüm matrisi için kullanılacak verileri elde edin: Üç boyutlu bir fantomu (örneğin, üç dolu küre) 200 μCi 18F sulu çözelti ile doldurun ve PET ile 15 dakika boyunca elde edin. Anatomik MRI verilerini alın: Tarama Kontrol Penceresinde, çok kesitli çoklu eko (MSME) dizisini seçin (bkz. Tablo 1). Üç ana oryantasyonun tümü için tekrarlayın: eksenel, sagital ve koronal.
2. İnfüzyon pompası ayarlarını ve çalışmasını kontrol edin. Pompayı dakikada 4,44 μl'ye ayarlayın, bu da 45 dakikalık sabit infüzyonda toplam 200 μl'lik bir hacim sağlar, bu da 20 g'lık bir hayvanda intravenöz (iv) enjeksiyon için önerilen tipik sınırdır.
3. Isıtıcının çalışmasını kontrol edin ve sıcaklık çıkışının hayvanı sıcak tutmak için yeterli olduğunu onaylayın (37 °C). Hayvanların hayvan yatağına yerleştirilmesine hazırlık olarak sıcaklık ve solunum izlemenin çalışır durumda olduğunu kontrol edin.
4. O2 ve N2 akış ölçerlerin (0,5 L/dk için: 57,2 mg/dk'da O2 ve 0,575 g/dk'da N2) hem basınçlı hava kaynağı kapalıyken hem de O2 ve N2 kaynakları açıkken gücünü vererek çalışmasını kontrol edin. Debimetrelere zarar verme riskini önlemek için, yeterli giriş basıncı olmadan açmayın.
5. İzofluran buharlaştırıcının yeterince doldurulduğundan emin olun. Görüntülemeden önce, izofluran anestezi akışını% 1-2 ve 0.5 ila 1 L / dk'da başlatın.
6. Anestezi, solunum pedi ve ısıtıcı sistemlerinin güvenli ve işlevsel bir şekilde konumlandırıldığından emin olarak hayvan yatağını hazırlayın. Ek PET/MRI ortak kayıt doğruluğu için, referans belirteçleri (örneğin, görüntüleme için enjekte edilene benzer bir konsantrasyonda radyoizleyici ile doldurulmuş kılcal tüpler) görüş alanı içindeki hayvan yatağına takılabilir.

3. Görüntüleme iş akışı Gerekli

tüm ekipman kontrolleri tamamlandıktan sonra, aşağıdaki gibi görüntülemeye devam edin:

1. Hayvanı izofluran ile uyuşturun ve heparinize salin (0.5 ml heparin, 1.000 USP / ml, 10 ml salin içinde) ile doldurulmuş kuyruk ven kateterini (28 G iğne, 5 cm'den az PE-10 tüpü) yerleştirin. Hayvanın ve/veya kuyruğun ısıtılması kateter yerleştirme doğruluğunu artırabilir. İsteğe bağlı olarak, IV hattını sabitlemek için yerleştirme yerine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin.
2. Hayvanı hazırlanan hayvan yatağına aktarın. Hayvanın başının sağlam olduğundan, üst kesici dişlerin diş çubuğuyla sabitlendiğinden ve kullanılıyorsa kulak çubuklarının yerinde olduğundan emin olun.
3. Kurumayı önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Rektal prob termometresini yerleştirin. Sıcaklık ve solunum okumalarının işlevsel olduğundan emin olun.
4. Uygun uzunlukta heparinize PE-10 tüpüne enjekte edilecek radyoizleyici dozunu (200 μl'de yaklaşık 600 μCi) çizin - PE-10 tüpü için yaklaşık 3 m ve 200 μl'lik bir hacim. Bu borunun bir ucunu infüzyon pompası şırıngaya, diğer ucunu da kuyruk ven kateter hattına bağlayın, boruda delik oluşturmamaya dikkat edin.
5. MRI bobininin ve herhangi bir hattın veya kablonun, özellikle de anestezi tüpünün konumunu bozmamaya dikkat ederek hayvan yatağını mıknatısın deliğine doğru kaydırın. Beynin merkezinin MRI bobininin, PET sisteminin ve MRI mıknatısının merkezleriyle aynı hizada olduğundan emin olun.
6. Bobin üzerindeki ayar düğmelerini çevirerek, empedansı en aza indirerek (bobin özelliklerini kontrol edin) ve frekans (300 Tesla'da 1H için 7 MHz) uyumsuzluklarını en aza indirerek MRI bobininin ayarını ve eşleştirmesini gerçekleştirin.
7. (MRI) Ayarlama ve eşleştirmeden sonra, bir izci görüntüsü elde edin: Yeniden Odaklanmış Yankılarla Hızlı Görüntüleme (RARE) tripilot dizisini seçin ve diziyi Tarama Kontrol Penceresinden çalıştırın. Hayvanın konumunu kontrol edin, 3.5 ve 3.6 adımlarını gerektiği gibi tekrarlayın. Şimleri sıfır değerine sıfırlayın.
8. (MRG) Beyin içindeki bir hacimde lokalize, nokta çözümlü bir spektroskopik tarama (PRESS) elde edin: 3,9 mm × 6 mm × 9 mm boyutlarında dikdörtgen bir hacimde bir PRESS dizisi (Tablo 1'e bakın) çalıştırın. CalcLineWidth makro komutunu kullanarak su hattı genişliğini kontrol edin. Yarı maksimum (FWHM) değerinde tam genişlik kabul edilebilirse (örn. 0,2 ppm), adım 3.10'a geçin. Değilse, adım 3.9'a geçin.
9. (MRI) Bir alan haritası edinin: Bir FieldMap dizisi çalıştırın (bkz. Tablo 1). MAPSHIM makro komutunu çalıştırarak ve doğrusal ve ikinci dereceden (z2) yerel ayarlamaları seçerek çok açılı projeksiyon altlığı (MAPSHIM) için elde edilen verileri kullanın. Adım 3.8'i tekrarlayın.
10. (MRI) Difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DWI) taraması için dilim planını konumlandırın (bkz. Tablo 1): Geometri Düzenleyiciyi kullanarak, edinme FOV'unun beyinde istenen ilgi hacmini elde edecek şekilde konumlandırıldığından emin olun. Elde edilen dilim planı istenildiği gibi hizalanırsa, sonraki tüm DWI taramaları için bu dilim planını Tarama Kontrolü Penceresi'ne kopyalayın. Satın almaya başlayın.
11. (PET) PET alımı hazır ve başlamaya hazır olduğunda, infüzyon pompasını başlatın. Kateterden salinin enjekte edildiği önceden belirlenmiş gecikmeden sonra, radyoizleyicinin girişini yakalamak için PET alımına başlayın (bkz. Tablo 1). Sayım oranını izleyin ve başarılı bir enjeksiyonun göstergesi olan sayımlarda kademeli bir artış olup olmadığına bakın.
12. 10-15 dakika sonra, adım 3.12 ile eş zamanlı olarak hipoksik mücadeleyi başlatın. Hipoksik tehdidi başlatmak için, tıbbi hava akışını kapatın ve %8 oksijen ve %92 nitrojen sağlamak ve izofluranı %0,8'e düşürmek için önceden belirlenmiş ayarlarla O2 ve N2 akış ölçerleri hemen açın. Giriş basıncı olmadan debimetreleri açmayın.
13. (MRG) Adım 3.12 ile aynı anda, adım 3.10'da hazırlanan DWI alımına başlayın ("H1" tarayın).
14. (MRI) H1 taraması tamamlandıktan hemen sonra, adım 3.10'da hazırlanan DWI alımına ("H2" taraması) başlayın. Akış ölçerleri kapatarak, tıbbi hava akışını eski haline getirerek ve fizyolojik izlemeye dayalı olarak izofluran konsantrasyonunu uygun bir değere döndürerek hipoksik zorluğu sona erdirin.
15. (MRI) Adım 3.10'da hazırlanan hipoksi sonrası DWI taraması edinin. Bu tarama tamamlandıktan sonra infüzyon pompasını kapatın.
16. (MRG) Aksiyel ve sagital düzlemlerde anatomik görüntüler elde edin. Tarama Kontrolü Penceresinde – MSME sırasını seçin (bkz. Tablo 1). Geometri Düzenleyici'yi kullanarak, edinme FOV'unun beyni kapsadığından emin olun.
17. Hayvanı çıkarın, ayaktan iken kafese dönün ve morbidite belirtilerini izleyin, gerekirse CO2 uygulamasıyla ötenazi yapın ve ardından ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık yapın.

Tablo 1. Protokolde açıklanan taramalar için MRG nabız dizisi parametreleri ve PET edinimi, histogram ve rekonstrüksiyon parametreleri.

Görüntüleme Edinme Parametreleri ve Donanım Edinme
Difüzyonu MRI (EPI-DWI)
Edinme süresi	15 dk
Matris boyutu	256 x 64
Dilimler	10
FOV	30 x 14 x 8 mm
Voksel boyutu	0.117 x 0.219 x 0.8 mm
Etkili spektral bant genişliği	150 kHz
TE	41 msn
TR	3.000 msn
Ortalamalar	6
k-uzay segmenti	16
b-değerleri	0, 400, 800 sn/mm2
Anatomik MRG (MSME)
Edinme süresi	5 dk
Matris boyutu	256 x 256
Dilimler	16
FOV	30 x 22 x 12,8 mm
Voksel boyutu	0,117 x 0,086 x 0,8 mm
TE	14 msn
TR	1.000 msn
Ortalamalar	1
Tekrarlar 1 Nokta Çözümlü Spektroskopik Tarama (PRESS)
Çekim süresi	15 sn
Voksel boyutu	3,9 x 6 x 9 mm
TE	20 msn
TR	2.500 msn
Ortalamalar	6
FieldMap
Alım süresi	1 dk 21 sn
1. TE	1,49 msn
2. TE	5,49 msn
TR	20 msn
Ortalamalar	1
PET Edinimi, Histogram, ve Rekonstrüksiyon Parametreleri
İzleyici	[18F] FDG
İnfüzyon hızı	4,44 μL/dak
Alım süresi	60 dk
Dilim başına görüntü boyutu	128 x 128
Dilimler	99
Voksel boyutu	0,4 x 0,4 x 0,6 mm
Dinamik çerçeveleme	12 x 300 sn
Rekonstrüksiyon türü	OS-MLEM (6 alt küme, 6 yineleme)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cerrahi
makas	Roboz	RS-5852
Forseps	Roboz	RS-5237
Hartman sivrisinek forseps	Miltex	7-26
2x McPherson dikiş forsepsleri, 8,5 cm	Doğru Cerrahi ve Bilimsel Aletler	4473	Karotis arteri tutmak için kullanılan forseps üzerinde bir bant ile açıklık genişliğinin azaltılmasında fayda vardır
6-0 silikon kaplı örgülü ipek sütür 3/8 C-1 iğneli	Covidien Sofsilk	S-1172
Homeotermik battaniye sistemi	Harvard Aparatı	507220F
Süper tutkal	(Jenerik)
O₂	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
için Hipoksi
O₂ metre	MSA	Altair Pro
Imaging
7.05 Tesla MRI Sistemi	Bruker	BioSpec	20 cm iç delik çapı, gradyan seti ile. Paravision 5.1 yazılımı.
Hacim Tx/Rx 1H Bobin, 35mm ID	Bruker	T8100
PET sistemi	(Kurum içi)		4x24 LSO-PSAPD dedektörleri
, dedektör başına 10x10 LSO dizisi,
1,2 mm kristal aralığı ve 14 mm derinlik. 14 x 14 mm PSAPD. Görüş Açısı: 60x35mm. 350-650 keV enerji penceresi. 16 ns zamanlama penceresi.
Damar kanülasyonu Dumont forseps	Roboz	RS-4991
PE-10 polietilen boru	BD Intramedic 427401
İnfüzyon pompası	Braintree Scientific	BS-300
Hayvan izleme ve geçit ekipmanları	Küçük Hayvan Aletleri A.Ş.	Model 1025	Sadece solunum izleme kullanılır,
Sıcaklık ayarlı hayvan yatağı	(Kurum içi)

Akış Ölçer N₂Alicat Scientific MC-5SLPM-D