Transfekte Edilmiş Primer Fare Serebral Korteks Hücrelerinin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Landeira, B. S.,et al., Primer Serebral Korteks Hücrelerinin 2D Kültür Sistemi Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Video, floresan etiketli kortikal progenitörleri izlemek, bölünmelerini ve farklılaşmalarını izlemek ve birincil serebral korteks hücrelerinde soy gelişimini incelemek için hızlandırılmış görüntülemenin kullanımını göstermektedir

Protokol

1. Hızlandırılmış Video mikroskobu

NOT: Bu adım, inkübasyon hazneli ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu gerektirir (bkz. Malzeme Tablosu).

1. Retrovirüs enfeksiyonundan sonra, doku kültürü plakasını sıcaklık ve CO₂ kontrolörlerine bağlı bir inkübatöre yerleştirin.
   NOT: Görüntülemeye başlamadan önce hazneyi 3 saat önceden ısıtmak, alım sırasında kaymayı ve odak bozukluğunu en aza indirmeye yardımcı olabilir.
   NOT: Hazne, hücreleri 37 °C ve %5_CO2 sabit koşullarında tutmalıdır.
2. Sıfır noktası (XY = 0) görevi görecek XY ekseninde bir konum seçin. Bu, bir referansın gelecekte pozisyonları tekrar bulmasını sağlayacaktır.
   NOT: Plaka üzerine sıfır noktasını belirlemek için referans olarak kullanılabilecek bir işaret çizilmesi tavsiye edilir.
3. 10X büyütmede görüntülenecek konumları seçin.
   NOT: Retroviral olarak transfekte edilmiş hücreleri gözlemleme olasılığını artırmak için kuyu başına 10-15 konum seçin.
   NOT: Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için uzun mesafeli yüksek büyütme hedefleri (20X veya 40X) kullanılabilir. Objektiflerin çalışma mesafesine bağlı olarak, cam tabanlı plakalar gerekebilir.
4. Fototoksisiteyi azaltmak için her 5 dakikada bir faz kontrast görüntüleri ve her 3 saatte bir floresan görüntüleri elde edin. Deneyin ilk 3 saatinde odağı kontrol edin ve ayarlayın, çünkü sıcaklık dengelenirken değişebilir. Odağı günlük olarak kontrol edin ve ayarlayın.
   NOT: İlk 24 saatten sonra odaklamanın sabit hale geldiğini gözlemliyoruz. Ancak, odağın izlenmesi tavsiye edilir. Alternatif olarak, yazılım tabanlı bir otomatik odaklama sistemi kullanın.
5. 7 gün sonra satın alma işlemini durdurun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zürih
Hücre gözlemci mikroskobu	Zeiss
İzleme Aracı (tTt) yazılımı		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html