$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Canlı İnternöronların Floresan Boyanması
1. Serebellar dilimleri geniş delikli cam kesik Pasteur pipeti ile 6 oyuklu bir plakaya aktarın (en fazla 3 dilim/oyuk başına). Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ortamını aspire edin.
2. Dilimleri (en fazla 3) 5 ml floresan boya (10 μM) yükleme çözeltisinde inkübe edin.
3. Işıktan korumak için mikroplakayı alüminyum folyo ile örtün. Hücre etiketlemeyi kolaylaştırmak için RT'de 10 dakika boyunca 35 rpm'de jiroskop hareket eden bir masaya koyun.
4. Dilimleri bir Transwell ekinin zarı üzerine aktarın (3.0 μm gözenek boyutu; Şekil 1D) geniş delikli cam kesik Pasteur pipeti ile. Yükleme ortamını pipet ile aspire edin.
5. Ek parçayı çıkarın ve kuyuyu 1.9 ml Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) ile doldurun. Ek parçayı değiştirin ve dokuyu kaplamak için dilimin üzerine 100 μl DMEM ekleyin.
6. Kültür eklerini içeren plakayı, moleküler katmandaki (ML) granül hücreleri (GC'ler) gözlemlemek için yeterli olan 2 saat boyunca inkübatör odasına (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin. Ekleme zarına yapışmaya izin vermek için dokuları düz bir şekilde yatırın (Şekil 1E). Dilimlerin kurumadığından emin olun.
2. Ex vivo Konfokal makroskopi ile görüntüleme
1. Plakayı plastik kapak olmadan konfokal bir makroskopun standına bağlı bir inkübatöre aktarın. Makroskopun plaka ekine bir cam kapak yerleştirin. Haznenin sıcaklığını 37.0 °C ± 0.5 °C'de tutun ve dilimleri sabit gaz akışı ile besleyin (%95 O2, %5 CO2) pH sabitini korumak için plaka ekinden geçirin. Hızlandırılmış deneyden önce 2 saat daha bekleyin.
2. Doku dilimlerinde GC göçünü görselleştirmek için, hazırlığı bir X2 kuru objektif (çalışma mesafesi: 39 mm, çap: 58 mm, NA = 0.234) ile donatılmış bir konfokal lazer tarama makroskopu aracılığıyla bir lazer diyot vasıtasıyla 488 nm dalga boyunda bir ışıkla aydınlatın ve 500 ila 530 nm arasında floresan emisyonunu tespit edin.
1. GC'lerin hareketini hassas bir şekilde çözmek için, 1,5 ila 2,0 arasında ek bir optik yakınlaştırma faktörüne sahip görüntüler elde edin. GC'lerin görüntülerini 12 saate kadar her 30 dakikada bir tek bir odak düzleminde veya z ekseni boyunca 10 adede kadar farklı odak düzleminde toplayın.
3. Gerektiğinde, cam kapağı çıkarın ve GC migrasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için 10 μl'lik bir pipetle DMEM'e küçük hacimlerde (1-10 μl) biyolojik aktivatör veya inhibitör ekleyin.
3. Hücre İzleme
1. Filmin her seferinde için, ImageJ'deki ecart tipi mod aracılığıyla z-stack projeksiyonu gerçekleştirin. Etiketli GC'lerin tanımlanmasını ve izlenmesini kolaylaştırmak için ardışık görüntülerin kontrast ve parlaklık seviyelerini modüle edin. Referans anlık görüntüsündeki her konumu manuel olarak eşleyin (t = 0'da).
1. Parçacık Analiz Menüsündeki "Manuel izleme" eklentisini kullanın ve timelapse sırasında her hücre gövdesinin ağırlık noktasına tıklayarak belirleyin. Ham izleme verilerini bir elektronik tabloda dışa aktarın.
2. ImageJ'den dışa aktarılan ham izleme verilerini, her bir hücreyi ve ilişkili konumları tanımlayan akıllı ev yapımı bir programla yeniden düzenleyin. Programı kullanarak, her hücre için toplam kat edilen mesafeyi ve ortalama göç hızını hesaplayın. Aynı programı kullanarak kontrol ve tedavi koşullarında hücre göçünün özelliklerini uygun filtreler altında sınıflandırır ve karşılaştırır.
