Konfokal mikroskopi kullanılarak fare nöral kök hücre bölünmesinin hızlandırılmış görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Daynac, M., et. al. Yetişkin Fare Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücrelerin Hücre Sınıflandırması ve Hücre Döngü Dinamiklerinin Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, transgenik bir fare beyninden alınan nöral kök hücrelerin (NSC'ler) konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak hızlandırılmış görüntülemesini göstermektedir. NSC'ler G1 fazı sırasında kırmızı floresan verir ve diğer hücre döngüsü fazlarında floresan değildir. Yapıştırılmış bir NSC kültürü görüntüleme odasına yerleştirilir, görüntüleme parametreleri ayarlanır ve istenen süre boyunca düzenli aralıklarla görüntüler yakalanır.

Protokol

1. Kültür ve Video Mikroskobu Öncesi Temel Kurulum

1. Konfokal video mikroskobu için cam tabanlı kültür plakaları veya μ Plakalar kullanın. 1 - 5 x 10³ hücre/kuyu için 96 oyuklu plaka kullanın ve 5 x 10^{3'ten fazla} hücre/kuyu için 24 oyuklu plaka kullanın.
2. Deneye başlamadan en az bir gün önce, yapışkan tek katmanlı kültürler için steril Poli-D-lizin (PDL) kaplı plakalar hazırlayın. Her bir kuyucuğun tabanını kaplamak için yeterli PDL (damıtılmış suda 10 μg / ml veya dH₂O) ekleyin ve gece boyunca 37 °C'de (O/N) inkübe edin. PDL solüsyonunu çıkarın ve plakanın laminer akış altında en az 2 saat boyunca davlumbazda kurumasına izin vermeden önce dH₂O ile üç kez durulayın. Hemen kullanılmayacaksa, kaplanmış plakayı -20 °C'de saklayın.
3. } Nöral kök hücre (NSC) Bazal Besiyeri ve NSC Proliferasyon Takviyesini 9:1 oranında karıştırarak kültür ortamını hazırlayın ( Malzeme tablosuna bakın) 2 μg/ml heparin, 20 ng/ml saflaştırılmış insan rekombinant epidermal büyüme faktörü (EGF) ile birlikte, ve 10 ng/ml insan rekombinant fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2). Kullanmadan önce kültür ortamını bir su banyosunda 37 ° C'ye ısıtın.
4. Subventriküler bölge (SVZ) ayrışması için papain çözeltisi hazırlayın: 0.2 mg / ml L-sistein, 0.2 mg / ml etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren Earl's Balance Tuz Çözeltisinde (EBSS) 1 mg / ml papain (15 UI / ml) ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 0.01 mg / ml DNaz I. Solüsyonu 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin. Kullanmadan önce çözeltiyi 37 °C'de dengeleyin.
5. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için bir proteaz inhibitör çözeltisi (Ovomucoid) hazırlayın: dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM): 0.7 mg / ml tripsin inhibitörü tip II içeren F12 ortamı. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin.
6. Beyinleri toplamak için PBS% 0.6 glikoz çözeltisi ve yıkama adımları ve antikor boyama için PBS% 0.15 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi hazırlayın.
7. Diseksiyon araçlarını hazırlayın: makas, diseksiyon ve bağlama forsepsleri ve bir neşter. Onları %70 etanole batırın.

2. Yetişkin Fare Beyinlerinin Toplanması ve SVZ Mikrodiseksiyonları

1. Yetişkin Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) farelerini (yaşlanma çalışmaları için 2 ila 3 aylık ve/veya 12 aylık) feda edin, uygun kurumsal yönergelere uygun olarak servikal çıkık gerçekleştirin.
2. Fareye% 70 etanol püskürtün ve keskin bir makas kullanarak kafayı kesin.
3. Kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca bir kesi yapın.
4. Küçük bir makas kullanarak kafatasının tabanından başlayarak koku soğancıklarına doğru uzunlamasına bir orta hat kesimi yapın. Makas bıçaklarıyla alttaki beyne zarar vermekten kaçındığınızdan emin olun. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasının üst açık kısmını kavisli forseps ile çıkarın.
5. Beyni, PBS'de% 0.6 glikoz içeren 15 mm'lik bir petri kabında toplayın.
6. Koku ampullerini inceleyin. Beyni sırt yüzeyine yerleştirin ve bir neşter kullanarak optik kiazmadan koronal bir bölüm yapın.
7. Diseksiyon mikroskobu altında, beyin bölümünün rostral kısmını, kesilen koronal yüzey deneyciye doğru yukarı bakacak şekilde konumlandırın.
8. SVZ'yi incelemek için, septumu ince kavisli forsepslerle çıkarın, ardından ince bir forsepsin bir ucunu ventrikülün hemen yanındaki striatuma sokun ve SVZ'yi çevreleyen dokudan ayırın. Diseke edilmiş SVZ'yi 1 ml PBS-0.6% glikoz içeren bir petri kabına yerleştirin.

3. SVZ Doku Ayrışması

1. }Parçalara ayrılmış SVZ'yi petri kabında büyük parçalar kalmayana kadar kıyın.
2. Kıyılmış dokuyu PBS-%0.6 glikoz ile birlikte 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın ve 0.01 mg / ml DNaz I ile desteklenmiş 1 ml önceden ısıtılmış papain (1.4. adımda hazırlanan 1 mg / ml) ekleyin. 37 ° C'de bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin. Fare başına 1 ml papain kullanın.
4. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
5. Papain aktivitesini durdurmak için 1 ml önceden ısıtılmış ovomukoid (0.7 mg / ml, adım 1.5'te hazırlanır) ekleyin. Bir p20 mikropipet ucu aracılığıyla 1000 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek kıyılmış dokuyu mekanik olarak tek hücreli bir süspansiyona ayırın. Hava kabarcıklarından kaçının.
6. Hücre süspansiyonunu 15 ml'lik yeni bir tüpte 20 μm'lik steril bir filtreden geçirin. Hücre kaybını önlemek için hücre filtresini PBS %0,15 BSA ile yıkadığınızdan emin olun.
7. 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri% 0.15 BSA içeren 100 μl PBS'de yeniden süspanse edin.

4. Hücre Sıralama için İmmünofloresan Boyama

FUCCI-Red fareler (Şekil 1A) kullanarak hücre sıralaması için, aşağıdaki antikorları kullanın: CD24 fikoeritrin-siyanin7 konjugatı [PC7]; CD15 / LeX floresein izotiyosiyanat [FITC] konjuge ve Ax647 konjuge EGF ligandı.

Not: LeX⁺EGFR⁺ hücreleri ve EGFR⁺ hücreleri yetişkin SVZ'de bol miktarda bulunmaz: sırasıyla 600 ve 1500 hücre/fare ≈. Yeterli malzemeye sahip olmak için SVZ hücrelerini 2 ila 3 fareden birleştirmenizi öneririz. Hücre sıralama süresinin 3 saati aşmaması için aynı gün içinde 12'den fazla fare ile çalışmayın. Aynı gün çok fazla fare ile çalışmanın, hücre sıralama süresinin artmasına neden olacağını ve muhtemelen hücre ölümünün ve / veya hücre farklılaşmasının artmasına neden olacağını unutmayın.

1. FACS boyamayı fare başına 100 μl PBS %0.15 BSA'da (veya optimum boyama için 2 ila 3 fareden oluşan bir grup için 200 μl'de) gerçekleştirin.
2. Kontrol tüplerini hazırlayın. Üreticinin protokolüne göre tek renk kontrol tüpleri hazırlamak için kompanzasyon boncukları kullanın. Hücrelerin bir kısmını seçin (bir fareden çıkarılan hücrelerin 1 / 10'u yeterlidir) ve 1 negatif kontrol tüpü (işaretlenmemiş hücreler) ve 3 floresan eksi bir (FMO) kontrol tüpü hazırlamak için 4 tüpe ayırın. Hücreleri tüp başına 200 μl PBS% 0.15 BSA içinde yeniden süspanse edin.
   İpucu: LeX-FITC FMO kontrolü için hücreleri CD24-PC7 (1:50) ve Ax647 konjuge EGF ligandı (1:200) ile etiketleyin; CD24-PC7 FMO kontrolü için, hücreleri CD15 / LeX-FITC (1:50) ve Ax647 konjuge EGF ligandı (1: 200) ile etiketleyin ve Ax647 konjuge EGF ligandı FMO kontrolü için, hücreleri CD15 / LeX-FITC (1:50) ve CD24-PC7 (1:50) ile etiketleyin.
3. Hücre sıralaması için kullanılan tüpler için, PBS% 0.15 BSA'da belirtilen seyreltmede aşağıdaki antikorları kullanın: CD24-PC7 (1:50), CD15 / LeX-FITC (1:50) ve Ax647 konjuge EGF ligandı (1:200).
4. Karanlıkta 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. 1 ml PBS% 0.15 BSA ile yıkayın ve 200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri beyin başına 200 μl PBS% 0.15 BSA'da yeniden süspanse edin. Hücre sıralama tüplerini buz üzerinde tutun ve hemen hücre sıralamasına geçin.
5. FUCCI-Green fareler kullanılıyorsa, LeX-FITC antikoru FUCCI-yeşil floresan ile aynı emisyon dalga boyunu paylaştığından, hücre sıralamasından önce ayırma sütunlarını kullanarak LeX-pozitif ve LeX-negatif fraksiyonları ayırın (Şekil 2A, B).
   1. İlk olarak, hücreleri 100 μl PBS% 0.15 BSA'da karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika boyunca bir fare anti-insan LeX-antikoru (1:50) ile etiketleyin.
   2. Hücreleri 1 ml PBS% 0.15 BSA ile yıkayın ve 200 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika boyunca fare önleyici IgM mikro boncukları (1:10) ile etiketleyin.
   3. Hücreleri 1 ml PBS% 0.15 BSA ile yıkayın ve 200 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 500 μl PBS %0.15 BSA'da yeniden süspanse edin ve hücreleri Şekil 2C'de şematize edildiği gibi manyetik alandaki ayırma kolonundan dökün. LeX negatif fraksiyonu elde etmek için kolonu 1 ml PBS% 0.15 BSA ile yıkayın.
   4. LeX pozitif bir fraksiyon elde etmek için, ayırma kolonunu manyetik alandan çıkarın ve hücreleri 2 ml PBS% 0.15 BSA ile elüte edin.
   5. 4.2'de belirtildiği gibi CD24-PC7 ve Ax647 konjuge EGF ligand boyamasına devam edin.

5. Hücre Sıralama

Not: Hücreler, 86 μm'lik bir nozul ile 40 Psi'de bir FACS sıralayıcıda sıralandı. Floresan aşağıdaki filtre seti kullanılarak toplandı: 520/35nm (FITC), 575/26nm (PE), 670/20nm (Ax647) ve 740LP (PC7). FUCCI kırmızısı floresan ve PC7 boyasının emisyon spektrumları arasında örtüşme bulunduğundan, yanlış pozitif sinyalleri önlemek için kompanzasyon gereklidir.

1. Hücre sıralamasından hemen önce, canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için hayati bir boya ekleyin. 2 μg/ml nihai konsantrasyonda Hoechst (HO) ( malzeme tablosuna bakınız) kullandık. Negatif kontrol tüpünü (işaretlenmemiş hücreler) FACS sıralayıcıdan geçirin ve yan saçılma (SSC) ve ileri saçılma (FSC) parametrelerini kullanarak hücreleri seçin (Şekil 3A).
   NOT: Ölü hücreler sadece HO-negatif fraksiyon geçitlenerek hariç tutuldu (Şekil 3A) ve daha sonra Darbe Genişliği negatif fraksiyonu seçilerek çiftler hariç tutuldu (Şekil 3A).
2. Adım 4.2'de hazırlanan tek renk kontrollerini çalıştırın ve gerekirse fotoçoğaltıcı tüp (PMT) voltajlarını ayarlayın (yani, negatif popülasyon çok yüksek ve/veya ölçek dışı pozitif hücreler). Yazılımın kompanzasyon penceresinde renk telafisi gerçekleştirin.
3. Adım 4.2'de hazırlanan FMO kontrollerini çalıştırın (LeX-FITC FMO kontrolü, CD24-PC7 FMO kontrolü ve Ax647 konjuge EGF ligand FMO kontrolü) ve sıralama kapılarını çizin (Şekil 3). Hücreleri doğrudan 1.5 ml'lik mikrotüplerde 100 μl kültür ortamına sıralayın.

6. Mikroskopi için Hücrelerin Hazırlanması

1. } Yeni sıralanmış hücreleri 1 - 3 x 10³ hücre/kuyu yoğunluğunda 300 μl kültür ortamı ile Poli-D-Lizin kaplı 96 oyuklu μ-Plaka üzerine yerleştirin.
2. Video mikroskobundan önce, hücre yapışmasını sağlamak için kültür plakalarını 37 °C ve% 5 CO₂ sıcaklıkta en az 1 saat inkübe edin.

7. Mikroskop Kurulumu ve Görüntü Toplama

1. %5 CO₂ atmosfer altında 37 °C'de ters termostatlı bir odaya bağlı konfokal lazer taramalı mikroskop sistemi üzerinde Plan Apo VC 20x DIC objektifi (NA: 0.75) kullanarak canlı görüntüleme gerçekleştirin.
2. 96 kuyulu μ-Plakayı önceden ısıtılmış ve dengelenmiş termostatlı odanın içine yerleştirin ve kapağı termostatlı bir kapakla değiştirin.
3. NIS-Elements yazılımını açın ve hızlandırılmış (uzunluk, aşama konumları, konfokal z-kesitleri ,...), hedefleri seçmek için "Alma/Edinme kontrolleri/Ti Pad" seçeneklerini seçmek için "Edinme/Edinme kontrolleri/ND edinimi" üzerindeki menü çubuğuna tıklayın ve menü çubuğundaki her floresan için PMT seviyesini seçmek için "Al/Edinme kontrolleri/A1plus Ayarları"na tıklayın. Veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin.
4. ND çekim penceresini kullanarak, her bir bölmenin merkezini sahne alanı konumu olarak ayarlayın ve büyük görüntü seçeneğini 7 x 7 mm² olarak belirleyin. Bu, her kuyunun merkezi etrafında mozaik bir görüntü oluşturacaktır. Büyük mozaik görüntünün çakışmasını %5 olarak ayarlayın. 24 saat boyunca her 20 dakikada bir fotoğraf çekin. Ti Pad penceresinde Plan Apo VC 20x DIC hedefini (NA: 0.75) seçin.
5. A1plus Ayarlar penceresinde, 1,26 μm/piksel çözünürlüğe sahip 512 x 512 piksel formatında yüksek hızlı bir rezonans tarayıcı kullanarak görüntüler elde edin. Hücre şekillerini görselleştirmek için parlak alanı kullanın. FUCCI-Red fareler söz konusu olduğunda, kırmızı floresanı 561 nm'de uyarın ve 595/50 nm'lik bir filtre kullanarak toplayın. FUCCI-Green fareler söz konusu olduğunda, yeşil floresanı 488 nm'de uyarın ve 530/40 nm'lik bir filtre kullanarak toplayın. Her dalga boyu için en uygun PMT seviyesini, ofseti ve lazer gücünü belirleyin.
   NOT: Yazılımın her çekimden önce her aşama konumunda otomatik odaklama yapmasına izin vermek için parlak alan kanalı için otomatik odaklama işlevini kullanmanızı öneririz. İpucu: Yağa ihtiyaç duymadan mükemmel çözünürlüğü için bir Plan Apo VC 20x DIC objektif (NA: 0.75) kullanılmıştır. İstenen optik çözünürlüğe bağlı olarak başka objektifler de kullanılabilir.
6. Alımı başlatmak için ND alımı penceresindeki 'Şimdi çalıştır' düğmesini seçin.

Sonuçlar

Şekil 1: FUCCI-Red fareler kullanılarak hücre döngüsünün canlı analizleri. (A) FUCCI-Red hücre döngüsünün şematik gösterimi, burada hücreler G sırasında kırmızı-floresan₁ faz ve S-G₂/M fazları sırasında renksizdir. (B) ...

Malzemeler