Serbestçe Hareket Eden Bir Farede Gerçek Zamanlı Mikroendoskopik Kalsiyum Görüntüleme

Özet

Kaynak: Lee, H. et. al., Serbestçe Davranan Farenin Amigdalasında Başa Monte Minyatür Mikroskopla Başarılı İn vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, gradyan kırılma indisi veya GRIN lens ve minyatür bir mikroskop kullanılarak bir farede in vivo kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Kurulum, sürtünmesiz bir mobil kafes sistemi içinde kafa sabitlemesini birleştirir, nöronları uyarır ve kalsiyum iyonu akışını tetikler. GRIN lens, beyindeki kalsiyum sinyalini yakalayarak nöronal aktivitenin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

NOT: Bu protokol altı ana adımdan oluşur: virüs enjeksiyon cerrahisi, gradyan kırılma indisi (GRIN) lens implant cerrahisi, GRIN lens implantasyonunun doğrulanması, taban plakası bağlantısı, GCaMP'nin optik kaydı (yeşil floresan proteini (GFP), kalmodulin (CaM) ve M13, miyozin hafif zincirli kinazdan bir peptit dizisi) bir davranış testi sırasında sinyal ve veri işleme (Şekil 1A). Ameliyat dışında ticari yazılım paketi (Inscopix) kullanılmaktadır.

1. Stereotaksik cerrahi - Adeno-ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu
NOT: Bu cerrahi prosedürde kullanılan fare suşu C57BL6/J'dir. Ameliyat sırasında hayvanın vücudu steril bir örtü ile örtülür ve protokoldeki tüm adımlar steril eldiven giyilerek gerçekleştirilir. Birden fazla ameliyat genellikle aynı gün içinde yapılmaz. Bununla birlikte, birden fazla farenin aynı gün aynı ameliyatı olması gerekiyorsa, fareler arasındaki cerrahi aletleri dezenfekte etmek için her fare için ayrı bir otoklavlanmış cerrahi alet seti ve %70 etanol kullanın. Cerrahi işlem sırasında fareyi sıcak tutmak için fare, stereotaksik çerçeveye sabitlendikten sonra özel yapım bir cerrahi battaniye ile örtülür.

1. Gerekli tüm cerrahi aletleri% 70 etanol ile dezenfekte edin ve bir Hamilton şırınga ve bir cam pipet hazırlayın. Cam pipeti damıtılmış su ile doldurun.
   NOT: Protokolde kullanılan tüm cerrahi aletler otoklavlanmıştır. GRIN lensi ve kafatası vidaları sterilizasyon için otoklavlanamadığından, iltihabı önlemek için dezenfektan olarak %70 etanol kullanılır. Denenmemiş olmasına rağmen, gaz veya kimyasal sterilizasyon gibi diğer sterilizasyon biçimleri kullanılabilir.
2. Fareyi pentobarbital (vücut ağırlığının 83 mg-kg-1'i) ile intraperitoneal enjeksiyon ile uyuşturun. Fare bilinçsiz hale geldikten sonra, kafatasındaki kürkü tıraş edin.
3. Kafatasının üzerindeki cildi% 70 etanol ile temizleyin ve fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin. Cildi dikkatlice çıkarın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak kafatası yüzeyini %35 hidrojen peroksit solüsyonu ile silin. Ameliyat sırasında kornea kurumasını önlemek için kayganlaştırıcı göz merhemi uygulayın.
   NOT: Aseptik cilt hazırlığı için sadece %70 etanol kullanımında genellikle bir sorun olmamasına rağmen, iyodoforlar veya klorheksidin çözeltisi ve %70 etanol gibi 3 alternatif dezenfektan turu kullanılması önerilir. Bu protokolde, fare kafatasındaki bağ dokusunun mümkün olduğunca tamamen çıkarıldığından emin olmak için daha yüksek bir hidrojen peroksit konsantrasyonu kullanılır, bu da daha sonraki görüntüleme sırasında hareket artefaktlarını azaltmak için kritik öneme sahiptir, çünkü kafatasındaki bağ dokusu, taban plakasının kafatasına sıkı bir şekilde bağlanmasını engeller. % 35 hidrojen peroksitin normalde kullanılandan (% 3) çok daha yüksek olduğu unutulmamalıdır.
4. Pimi stereotaksik bir prob tutucu ile sabitleyin. Bregma ve lambda'nın yüksekliğini pim ile hizalayın.
5. Kraniyotomi için fare kafatası üzerindeki belirli konumu bulun.
   NOT: Virüs enjeksiyonu için lateral amigdala (LA) koordinatları (AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.5 mm, -4.3 mm) bu protokoldeki bregma'dan (AP; ön-arka, ML; Medial-Lateral, DV; Dorsal-Ventral, her kısaltma bregmadan göreceli eksenel mesafeyi gösterir). Koordinatlar her deneysel koşul için optimize edilmelidir.
6. Kafatası yüzeyini delin (Şekil 1B). Kafatası fraksiyonlarını fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Forseps veya 27 G'lik bir iğne kullanarak kalan tabakayı çıkarın.
   1. Kafatasını delerken, beyin dokusu yüzeyine zarar vermemek için son dura katmanına dokunmamaya çalışın. Hasarlı bir beyin yüzeyi, lens çevresinde iltihaplanmaya neden olur, bu da kayıt sırasında ciddi hareket artefaktlarına ve yüksek otofloresansa neden olur. Kraniyotomi 1.6 mm'dir. Delme hızı 18.000 rpm ve uç boyutu 0,6 mm'dir.
7. GRIN lensini delinen bölgenin beyin dokusu yüzeyinden hedef amigdala bölgesine indirmek için, bregma ile açıkta kalan beyin yüzeyi arasındaki DV farkını, bregmaya göre ayarlanan lens implantasyonunun DV koordinatından çıkararak "Değer A" olarak adlandırılan mesafeyi hesaplayın (bu durumda 4,2 mm, Şekil 1C).
8. Cam pipete 3 μL mineral yağ ve 0,7 μL AAV virüs solüsyonu yükleyin.
   NOT: Mineral yağ, virüs solüsyonu ile suyu ayırmaya yardımcı olur. 0,7 μL, LA'yı tamamen kaplayabilen LA virüsü enjeksiyonu için optimize edilmiş bir hacimdir.
9. Pimi stereotaksik prob tutucusundan çıkarın ve cam pipeti ona sabitleyin.
10. Cam pipeti adım 1.5'te belirtilen enjeksiyon yerine yerleştirin. Kanama tamamen durduktan sonra cam pipeti beyin dokusuna yerleştirin.
11. Virüsü bir enjeksiyon pompası kullanarak bir cam pipetten geçirin.
    NOT: Yeterli sayıda GCaMP eksprese eden hücre elde etmek için virüsün titresi 1 x 1013 vg/mL'den yüksek olmalıdır. Enjeksiyon hızı 0.1 μL / dak'dır ve 10 dakika boyunca yayılır. Kanama varsa, beyin yüzeyini PBS ile yıkayın. Bu adımda beyin yüzeyini ıslak tutun.
12. Enjeksiyonu bitirdikten sonra cam pipeti yavaşça çıkarın.

2. Stereotaksik cerrahi – GRIN lens implantasyonu
NOT: GRIN lens implant cerrahisi bu protokoldeki en kritik adımdır. GRIN lens hareketinin tutarlı bir yavaş hızı, başarılı GRIN lens implantasyonu için kritik öneme sahip olduğundan, motorlu bir cerrahi kol faydalı olabilir. Motorlu cerrahi kol, bilgisayar yazılımı tarafından kontrol edilen stereotaksik bir manipülatördür. Bu protokolde motorlu kol kullanılsa da, implantasyon sırasında lens tutarlı ve yavaş hareket ettiği sürece başka yollar da kullanılabilir. Cihaz ile ilgili detaylı bilgi Malzeme Tablosu'nda yer almaktadır.

1. İki kafatası vidasını implante etmek için kafatasını delin. Tüm kafatası fraksiyonlarını PBS.
   NOT: Daha sonraki optik görüntülemede hareket artefaktlarını azaltmak için en az iki vida gereklidir. İki kafatası vidası ve GRIN lens implant pozisyonu bir eşkenar üçgen oluşturur (Şekil 1B). Kraniotominin boyutu, vidanın çapına sıkıca uymalıdır. Kanama varsa, kanayan yüzeyi PBS ile yıkayın. Delme hızı 18.000 rpm ve uç boyutu 0,6 mm'dir.
2. Enflamasyonu önlemek için vidaları% 70 etanol ile dezenfekte edin. Vidaları mümkün olduğunca derine implante edin.
   NOT: Vidalar, çimento gibi ek bir yapışma olmadan sıkıca sabitlenmelidir.
3. Stereotaksik çerçeveye motorlu bir ameliyat kolu takın. Gerekli donanımı, kontrol yazılımının kurulu olduğu dizüstü bilgisayara bağlayın (Malzeme Tablosu).
4. GRIN lensini indirmeden önce, 26 G'lik bir iğne ile bir iğne izi yapmaya hazırlanın.
   NOT: İğne izi, enjeksiyon yolu boyunca beyin yapısında ciddi bozulmaya neden olmadan nispeten kalın GRIN lensini amigdala gibi derin beyin bölgelerine implante etmeye yardımcı olan bir tür kılavuz izdir. Bu kılavuz iz, iğne izi olarak adlandırılır, çünkü nispeten ince bir 26 G iğnenin alçaltma ve kaldırma prosedürü ile yapılır.
5. İğneyi stereotaksik çerçeve üzerinde sabit bir şekilde tutmak için kanül tutucuyu takın.
6. 26 G iğneyi kanül tutucu ile kavrayın ve iğne yerleştirme yerinin koordinatlarını hesaplayın.
   NOT: Bu protokolde, iğne yerleştirme bölgesinin koordinatları virüs enjeksiyon bölgesinden (AP, ML, DV) 50 μm lateraldir (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
7. Kontrol yazılımına erişin ve iğne pozisyonunu manipüle etmek için eksiksiz bir hazırlık yapın.
   1. Kontrol yazılımını çalıştırın ve kontrol oturumunu başlatmak için Yeni proje başlat düğmesini seçin.
      NOT: Kontrol oturumunda birkaç boş kutu ve menü düğmesi vardır. Boş kutular koordinatlar için giriş alanlarıdır. Boş kutulara koordinatları girdikten sonra, motorlu stereotaksik kol Git düğmesine tıklanarak hareket eder. Git düğmesi, stereotaksik kol hareket ederken bir STOP düğmesine dönüşür. Birkaç menü düğmesi arasında, bu protokolde yalnızca Araç düğmesi gereklidir.
   2. Araç düğmesine tıklayın. Çerçeveyi kalibre et menü düğmesine tıklayarak kontrol yazılımını kalibre edin. Kalibrasyon, manipülatörün gerçek konumunun Stereodrive yazılımında değerler olarak ayarlandığı işlemdir.
8. Stereotaksik bir manipülatör kullanarak kafatası yüzeyindeki açıkta kalan beyin yüzeyinde iğnenin ucunu bulun.
   NOT: İğnenin hızı, Tool (Araç) menüsündeki Microdrive speed (Mikro sürücü hızı) menüsü kullanılarak ayarlanır. Varsayılan hız 3,0 mm/sn'dir. Ancak bu adımda 0,5 mm/sn'lik bir hız önerilir. İğnenin hareketi yön tuşları ile kontrol edilir.
9. Beyin yüzeyini ıslak tutmak için 2-3 damla PBS ekleyin. Bilgisayar ekranındaki boş kutuyu LA'nın uygun DV koordinatlarıyla doldurun. Beyin yüzeyinin kuru olması iğnenin beyin dokusuna nüfuz etmesini engeller.
10. Git düğmesine tıklayarak 26 G iğnesini indirin. İğne DV koordinatları ile belirlenen hedef bölgeye ulaştığında otomatik olarak durur. İğnenin hızı 100 μm/dk'dır. Kanama varsa STOP butonuna tıklayarak iğneyi durdurun ve beyin yüzeyini PBS ile yıkayın. Bu adımda beyin yüzeyini ıslak tutun. Kanama durduktan sonra tekrar indirmeye başlayın.
11. İğnenin hareketi tamamen durduktan sonra, bilgisayar ekranındaki boş kutuya 45.00 mm girin.
    NOT: 45.00 mm, iğnenin başlangıç konumuna geri dönmesini sağlayan bir DV koordinat değeridir.
12. Git düğmesine tıklayarak iğneyi yükseltin. İğne hareketinin hızı 100-200 μm/dk'dır.
13. İğne hareket etmeyi bıraktıktan sonra, beyin yüzeyindeki PBS'yi çıkarın. İğneyi ve kanül tutucuyu stereotaksik çerçeveden çıkarın. Deneyci, gerektiğinde STOP düğmesine tıklayarak iğneyi manuel olarak durdurabilir.
14. Stereotaksik çubuğu lens tutucu ile donatın. GRIN lensini lens tutucusuna takın.
    NOT: Bu protokolde LA'yı (0,6 mm çapında, 7,3 mm uzunluğunda) hedeflemek için optimize edilmiş GRIN lensi kullanılır. Lens tutucu hazırlanmamışsa, alternatif bir yol, GRIN lensi kavramak için bir bulldog klipsi kullanmaktır.
15. Lensi %70 etanol ile dezenfekte edin ve stereotaksik çubuğu stereotaksik çerçevelere takın.
16. GRIN merceğinin ucunu kafatası yüzeyinde belirlenen yere yerleştirin (adım 2.8'de açıklanan yöntemin aynısı).
    NOT: GRIN merceğinin koordinatı (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) şeklindedir (Şekil 1C). Lens, ucuna zarar vermemek için kafatasına temas etmemelidir.
17. Adım 2.16'da açıklanan lens implantasyonunun DV koordinatından "Değer A"nın mutlak değerini çıkararak DV koordinatını hesaplayın.
18. Beyin yüzeyine 2-3 damla PBS damlatın. Bilgisayar ekranındaki boş kutuya lensi indirmek için 1000 μm ve yükseltmek için 300 μm girin.
19. GRIN lensini hedef bölgeye ulaşana kadar alçaltmayı (1000 μm aşağı) ve kaldırmayı (300 μm yukarı) tekrarlayın. Bu yukarı ve aşağı prosedür, lensin alçaltma prosedürü nedeniyle beyin dokusu içinde oluşan basıncın serbest bırakılmasına yardımcı olmak için kullanılır, aksi takdirde implantasyon yolu boyunca beyin yapılarının bozulmasına neden olabilir.
    NOT: GRIN lens hareketinin hızı 100 μm/dk'dır. Kanama olsa bile GRIN lensini hareket ettirmeyi bırakmayın ve beyin yüzeyini PBS ile yıkayın. Bu adımda beyin yüzeyini ıslak tutun. Beyin yüzeyi kuru ise beyin dokusu GRIN lens yüzeyine yapışır ve beyin yapısının bozulmasına neden olur.
20. GRIN lensi hedef bölgeye ulaşırsa, PBS'yi çıkarın ve reçine diş çimentosunu GRIN lensinin, vidaların ve yan duvarlarının etrafına dikkatlice uygulayın (Şekil 1D).
    NOT: Reçine simanını kafatasının her yerine uygulamak hareket artefaktlarını azaltabilir. Aksine, reçine çimentosu yanlışlıkla kafatasına bağlı kasları kaplarsa, hareket artefaktlarını arttırır.
21. Reçine diş çimentosu sertleştikten sonra, GRIN lensini lens tutucusundan sökün ve kafatasının her yerine akrilik çimento uygulayın (Şekil 1D).
22. Kafa plakasını takmak için, lens tutucuyu stereotaksik çubuktan sökün ve kafa plakasını bantlar kullanarak çubuğun ucuna takın. Kafa plakasının yatay olup olmadığını onaylayın.
    NOT: Eğik bir kafa plakası eğik bir görünüme neden olur. Fare kafasını mobil ev kafes sistemine (taban plakası bağlantı bölümünde) sabitlemek için bir kafa plakası gereklidir. Deneyci sistemi kullanmıyorsa, bu adımı (adım 2.22) ve sonraki adım 2.23'ü atlayın.
23. Başlık plakası lens manşetinin üst kısmına gelene kadar çubuğu yavaşça indirin. Kafa plakasını 1000 μm daha indirin. İmplante edilmiş GRIN lensin kafa plakasını, kafa plakasının iç halkasının sağ kenarına yerleştirilecek şekilde hareket ettirin.
    NOT: Kafa plakası, implante edilen GRIN lens yüzeyinden daha alçakta konumlandırılmalıdır; aksi takdirde, mikroendoskop, akrilik çimento nedeniyle odak düzlemini ayarlamak için implante edilen GRIN merceğine yeterince yaklaşamaz.
24. Kafa plakasını çimento katmanlarına tutturmak için akrilik çimento uygulayın (Şekil 1D).
25. Lens yüzeyini tozdan korumak için implante edilmiş GRIN lens yüzeyine parafin filmi yapıştırın. Ardından, parafin filmini lens yüzeyinde tutmak için parafin film üzerine çıkarılabilir bir epoksi bağ uygulayın.
26. Bir analjezik olan Carprofen (PBS'de 0.5 mg / mL) ve bir anti-enflamatuar ilaç (PBS'de 0.02 mg / mL) çözeltisi olan Deksametazon'u farenin periton boşluğuna enjekte edin.
    NOT: İlacın dozu vücut ağırlığına bağlıdır: Carprofen (5 mg-kg-1 vücut ağırlığı) ve Deksametazon (0.2 mg-kg-1 vücut ağırlığı). Hem Carprofen hem de Deksametazon ameliyattan sonra ve ameliyattan sonraki 7 gün boyunca günde bir kez uygulanır.
27. Bir antibiyotik olan 0.3 mg / mL amoksisilin i ev kafesi suyunda karıştırın ve ilacı 1 hafta boyunca uygulayın.
28. Fareyi ev kafesine geri koyun ve iyileşme ve virüs iletimi için 5-8 hafta bekleyin.
    NOT: Fare, anesteziden uyanana kadar elektrikli bir battaniye üzerinde önceden ısıtılmış bir kafeste geri alınır.

3. GRIN lens implantasyonunun doğrulanması
NOT: GRIN lens implantasyonunun doğrulanması, implante edilen GRIN lensin GCaMP eksprese eden hücrelere hedefte olup olmadığı hakkında bilgi sağlar. Bu bilgilere dayanarak, deneyci, hedef dışı GRIN lens implantasyonu olan hayvanları dışlayarak davranış testi ve veri işleme gibi zaman alıcı süreçlerden zaman kazanır. Doğrulama prosedürü sırasında, GCaMP ifadesine sahip hücreler kayıt görüş alanına odaklanmalıdır. Bu adımda bir mobil ev kafesi kullanılır. Mobil ev kafesi, GRIN lens implantasyonu ve taban plakası bağlantısının doğrulanması sırasında kafaya sabitlenmiş farelerin bacaklarını serbestçe hareket ettirmesine izin veren özel, yuvarlak şekilli bir cihazdır. Kafaya sabitlenmiş farelerin bacaklarının yerleştirildiği bu aparattaki bir hava kaldırma masası, kafa sabit olmasına rağmen bacakların bu şekilde serbest hareket etmesini sağlar. Amigdalanın lateral çekirdeğindeki hücreler genellikle dinlenme veya anestezi altında sessizdir, bu nedenle GCaMP floresan sinyalleri bu koşullarda nadiren tespit edilir, bu da GRIN lens implantasyonu ve taban plakası ekinin doğrulanması sırasında GCaMP eksprese eden hücreleri bulmayı çok zor, bazen imkansız hale getirir. Bununla birlikte, bacakların hareketi genellikle amigdalanın lateral çekirdeğinin hücrelerinde GCaMP floresan sinyalleri üretir ve böylece mikroskobun yerini belirlemeye yardımcı olabilir. Bu nedenle, bu protokolde mobil ev kafesi kullanılır.

1. Stereotaksik manipülatörü mobil ev kafes sistemine monte edin.
2. Fareyi %1.5 izofluran gazı ile uyuşturun. Fare tamamen bilinçsiz hale geldikten sonra, fareyi mobil ev kafes sisteminin baş çubuğuna yerleştirin.
3. Farenin altındaki karbon kafesi bulun. Karbon kafesi kapatın ve kafesin sürtünme olmadan serbestçe hareket etmesini sağlamak için hava akışını açın. Fare aktif hale gelene kadar birkaç dakika bekleyin.
   NOT: Hava akış hızı her deney koşulu için optimize edilmelidir (burada, 100 L/dak).
4. İmplante edilmiş GRIN lensin yüzeyindeki parafin filmi ve epoksi bağı çıkarın ve lens kağıdı kullanarak lens yüzeyini %70 etanol ile silin.
5. Veri toplama (DAQ) yazılımını hazırlayın (ör. Inscopix). Görüntüleme koşullarını ayarlayın.
   NOT: DAQ yazılımı, mikroskobu (ışık yayan diyot (LED) gücü, lens odağı vb.) ve veri depolamayı kontrol etmek için kullanılır.
   1. DAQ kutusunu açın ve üzerine bir mikroskop takın. Ardından, doğrudan bir kablo kullanarak veya kablosuz internet aracılığıyla bir dizüstü bilgisayara bağlayın.
      NOT: DAQ yazılımı, DAQ kutusu adı verilen ekstra donanıma (örn. Inscopix) kurulur. DAQ kutusunu dizüstü bilgisayara bağlayarak, DAQ yazılımı bir dizüstü bilgisayarda erişilebilir hale gelir.
   2. DAQ yazılımına bir internet tarayıcısı aracılığıyla erişin (Firefox önerilir).
   3. Tanımlı Oturumda gerekli tüm ayrıntıları (Tarih, fare kimliği vb.) ayarlayın. Ardından Kaydet ve Devam Et'i tıklayın. Kaydettikten sonra Çalıştır oturumuna erişin.
   4. Çalıştırma Oturumunda, pozlama süresi, kazanç, elektronik odak ve pozlama-LED gücü gibi görüntüleme koşullarını ayarlayın.
      NOT: Kazanç ve pozlama-LED gücü laboratuvar koşullarına bağlı olarak değiştirilebilir. Elektriksel odak için önerilen değer 500 ve maruz kalma süresi 50 ms'dir. LED gücünü ve kazancını değiştirmek için herhangi bir kısıtlama yoktur. Bununla birlikte, daha yüksek bir ışık yoğunluğu daha fazla beyazlatmaya neden olabilir. Kaydın pozlama süresi, video kaydının kare hızını belirler. Daha yüksek kare hızları, sinyal yoğunluğunu azaltacaktır. Kare hızları, görüntüleme için kullanılan GECI'ler için optimize edilmelidir.
6. Mikroskobu bir stereotaksik manipülatörde tutmak için, stereotaksik çubuğu bir mikroskop tutucu ile stereotaksik manipülatöre takın.
   NOT: Tutucu, bir mikroskop gövdesini hedef beyin konumuna yerleştirmek üzere tutmak için stereotaksik cihaza takılabilen küçük bir aksesuardır.
7. Mikroskobu mikroskop tutucusu ile kavrayın. Mikroskoba bağlı LED ışığını açın ve mikroskobu dikey olarak hizalayın. Görüntüyü izlerken, implante edilmiş GRIN lensinin yüzeyi görünene kadar mikroskobu indirin.
8. İmplante edilmiş GRIN merceğinin merkezini görüntünün merkeziyle hizalayın.
   NOT: GRIN lens implantasyonunun doğrulanması bu adımda gerçekleştirilebilir (sonuç bölümünde belirtilmiştir, Şekil 2B, Şekil 2D, Şekil 2F).
9. İmplante edilmiş GRIN lens yüzeyinin görüntüsünü yakalayın (Klavyedeki Prt Sc düğmesine tıklayın). İmplante edilen GRIN lens yüzeyinin görüntüsü, daha sonraki veri işleme sırasında nöronal olmayan bileşenlerin seçimini kaldırmak için gereklidir (adım 6.8).
10. Mikroskobun uygun pozisyonunu bulun. GCaMP7b ifadesine sahip hücreleri aramak için görüntüyü gözlemlerken mikroskobun objektif merceğini yavaşça kaldırın.
    NOT: Görüntü elde etme kazancını veya pozlama LED gücünü ayarlamak gerekebilir. GRIN lens implantasyonunun validasyonu bu adımda gerçekleştirilebilir (sonuç bölümünde, Şekil 2A, Şekil 2C, Şekil 2E'de belirtilmiştir).

Sonuçlar

Şekil 1: LA'da in vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme için stereotaksik cerrahi için şematik iş akışı ve diyagramlar. (A) LA'da in vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntülemenin şematik bir iş akışı. (B) Virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implant cerrahi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
26G iğne	BD	302002	Cerrahisi
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	Cerrahisi
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	ısmarlama		Cerrahi
Akrilik-diş çimentosu (Orto-jet Akrilik Pembe)	Lang	1334-pembe	Cerrahi ve taban plakası eki
Hava akışı manipülatörü	Neurotar	NTR000253-04	Taban plakası eki
Amoksisilin	SIGMA	A8523-5G	Cerrahi
Karbon kafes	Neurotar	180mm x 70mm	Taban plakası eki
Carprofen	SIGMA	PHR1452-1G	ameliyat
Veri işleme yazılımı	INSCOPIX	INSCOPIX Veri İşleme Yazılımı	Taban plakası eki ve davranış testi
Deksametazon	SIGMA	D1756-500MG	Cerrahi
Matkap	Seyang	maratonu-4	Cerrahi
Matkap frez	ELA	US1/2, Shank104	Cerrahi Cam
iğne	WPI	PG10165-4	Cerrahi
GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probu)	INSCOPIX	1050-002208	Cerrahi
Hamilton Şırınga	Hamilton	84875	Cerrahi
Kafa plakası	Neurotar	Model 5	Ameliyat
Dizüstü bilgisayar	Samsung	NT950XBV
Cerrahi Lens tutucu, Stereotaksik çubuk (INSCOPIX proview implant kiti)INSCOPIX		1050-004223	Cerrahi
Mikroskop tutucu	INSCOPIX	1050-002199	Taban plakası eki
Mikroskop, DAQ yazılımı, donanım	INSCOPIX	nVista 3.0	Taban plakası bağlantısı ve davranış testi
Mobil ev kafesi	Neurotar	MHC V5	Taban plakası eki
Moterize kol	Neurostar	Özelleştirilmiş	Cerrahi
Moterize kol yazılımı	Neurostar	Özelleştirilmiş	Cerrahi
Çıkarılabilir epoksi bağ	WPI	Kwik-Cast	Cerrahi
Reçine çimentosu (Süper bağ)	Güneş tıbbi	Süper bağ C&B	Cerrahisi
Kafatası vidası	Çalmak	51457	Cerrahi
Stereotaksik çerçeve	Çalmak	51600	Cerrahi
Stereotaksik manipülatör	Çalma	51600	Taban plakası eki