Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanılarak Bir Fare Beyin Koroid Pleksusunun Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Van Wonterghem, E., et al. Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tam Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak bir fare beyninden alınan koroid pleksus dokusunun hazırlanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir. İşlem, numuneyi stabilize etmek ve görüntülemeye hazırlamak için doku fiksasyonu, dehidrasyon ve iletken bir platin tabaka ile kaplamayı içerir. SEM, mikrovilluslu epitel hücrelerinin ayrıntılı görüntülerini yakalayarak dokunun yapısal özellikleri hakkında bilgi sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak koroid pleksus (CP) dokusunun morfolojik analizi

DİKKAT: Aşağıdaki işlem adımlarında toksik çözeltiler kullanılır. Numune hazırlamanın çeker ocakta yapılması tavsiye edilir.

1. SEM için numune hazırlığını aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. Taze izole edilmiş CP'yi, 0.1 M Na-kakodilat tamponunda (pH 7.4) %2 paraformaldehit ve %2.5 glutaraldehit içeren yeni yapılmış fiksasyon çözeltisine aktarın. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: CP dokusu çok kırılgan ve ince olduğundan, doku tamponlar arasında transfer etmek için küçük örnek sepetlerine konulmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu sayede dokunun yapısı daha iyi korunmuş olacaktır. Güçlü kakodilat tamponu, EM fiksatifindeki düşük glutaraldehit pH'ına karşı koyabileceğinden, fosfat tamponlu salin (PBS) bazlı bir fiksatif üzerinde bir kakodilat bazlı fiksatif kullanılır.
   2. Numuneyi 3x, her biri 5 dakika boyunca 3-5 mL 0.1 M Na-kakodilat tamponu (pH 7.4) ile yıkayın.
   3. Numuneleri 3.1 M Na-kakodilat tamponunda 3-5 mL% 2 osmiyum tetroksit içinde 30 dakika boyunca sabitleyin. Numuneleri 3 kez 5 dakika boyunca her biri 3-5 mL ultra saf su ile yıkayın.
   4. Numuneleri, EtOH çözeltisi başına 15 dakika boyunca artan etanol (EtOH) konsantrasyonlarında (%50, %70, %85, %100) bir dizi buz gibi soğuk çözeltide kurutun. Numuneyi düzgün bir şekilde kurutmak için kritik nokta kurutucu kullanın. NOT: Sıvı fazdan gaz fazına geçmek yüzey gerilimini etkileyerek yüzey yapısına zarar verir. Kritik nokta kurutma adımı, yüzey yapısının korunmasına izin verir.
   5. Numuneyi, bir karbon çıkartma ile donatılmış bir numune yuvasına dikkatlice yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
   6. Numuneleri ince bir tabaka (2-5 nm) platin ile kaplayın. Bunu yapmak için, iki yüksek akımlı elektrik terminali arasına bir vakum sistemine bir platin kaynağı monte edin ve platini buharlaşma sıcaklığına kadar ısıtın. Numune üzerinde ince bir platin akışı biriktirilir. NOT: Platinin yanı sıra altın veya altın/paladyum da kullanılabilir.
2. CP örneklerini SEM ile görselleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). CP dokusunun SEM aracılığıyla görselleştirme prosedürü, diğer doku tiplerininkine benzer ve kullanılan yazılıma ve aletlere bağlıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alüminyum numune bağlantıları	EM Sciences	75220
Kakodilat tamponu	EM Sciences	11652
Karbon yapışkan tırnaklar -12 mm	EM Sciences	77825-12
Kritik nokta kurutucu	Bal-Tec	CPD030
Kiriş 540	Zeiss		SEM sistemi
Forseps	Güzel Bilim Araçları GmbH	91197-00
Glutaraldehit	EM Bilimleri	16220
Osmiyum Tetroksit	EM Bilimleri	19170
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platin	Çekirdek	Q150T ES	PBS, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ veya fenol kırmızısı içermez; steril filtreli
Numune Sepeti Paslanmaz Çelik	EM Bilimleri	70190-01