Amyotrofik Lateral Sklerozun İn Vitro Modelinde Sinaptik Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Özet

Kaynak: Krishnamurthy, K. et al. Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum biyosensörünü ifade eden ALS mutant nöronlarındaki sinaptik aktiviteyi izlemek için gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Nöronal sinaptik aktiviteyi yansıtan hücre içi kalsiyum seviyelerindeki gerçek zamanlı değişiklikleri ölçmek için nöronları görüntüleme, kalsiyum dinamiklerini uyarma ve floresan kaydetme adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

1. Gcamp6m kalsiyum geçici hastalarının floresan görüntülemesi

1. 500 ng Gcamp6m.
   NOT: İstenirse, kırmızı veya uzak kırmızı aralıkta bir floresan etiketi içeren ilgilenilen bir plazmid ile nöronları birlikte transfekte edin.
2. Nöronları düşük potasyum klorür (KCl) yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) (Tablo 1) ile transfeksiyondan 15 dakika, 48 saat sonra inkübe edin ve ardından çanağı görüntüleme platformuna monte edin.
3. Bir floresein izotiyosiyanat (FITC) filtresi (488 nm) ve 20x veya 40x objektif kullanarak GCaMP6m floresansını görselleştirin.
4. Görüntüleme alanını seçin ve mükemmel odaklamayı devreye alın. Ardından, nöronal sınırları işaretlemek için parlak alan, FITC ve floresan işaretleyici kanallarına sahip tek bir hareketsiz görüntü çekin.
5. Edinme yazılımında Şimdi Çalıştır'ı başlatın. Temel kaydı 5 dakika boyunca gerçekleştirin ve ardından 50 mM KCL içeren aCSF ile perfüze edin (Tablo 1).
   NOT: Bu görüntülemenin amacı, uyarılmış kalsiyum geçişlerini ölçmektir. Bir nöron, ön stimülasyon döneminde bazal ateşleme aktivitesine ve kalsiyum akışlarına sahipse, veri analizinde kullanılmaz. Bunun yerine, yalnızca kararlı arka plan floresansına sahip hücreler kullanılır. Stimülasyon sonrası periyotlar, ek sürekli yüksek KCl perfüzyonu olsun veya olmasın, kalsiyum geçişleri için 60 dakikaya kadar uzatılabilir.
6. Deneyi kaydedin ve konfokal yazılımı kullanarak verileri analiz edin. Deney bu noktada durdurulabilir ve analiz daha sonra gerçekleştirilebilir.
   NOT: Hücreler, ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için transfeksiyona ihtiyaç duymuyorsa, bu protokol, kalsiyum geçişlerini incelemeye çalışırken in vitro herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Kalsiyum geçişlerinin ölçümünü sağlamak için kontrol hücrelerinin test edilmesinin ardından, deneyci, yanlılığı en aza indirmek için test edilen her yemeğin genetik veya farmakolojik koşullarına karşı kör olmalıdır.

2. Görüntü analizi

:

1. Konfokal yazılımla hızlandırılmış görüntüleri açın.
2. Zaman atlamalı serilerdeki görüntüleri komut serisine göre hizalayın: Görüntü | İşleme | Geçerli Belgeyi Hizala. İlk kareye hizala'yı seçin.
3. Görüntü çerçevesinin sağında fasulye şeklinde bir simge olan ROI seçim aracını kullanarak nöritler boyunca ilgi alanlarını (ROI'ler) seçin. Ayrıca, arka plan floresan yoğunluğunu temsil eden bir ROI'yi işaretleyin.
   NOT: ROI'ler, parlak alan hareketsiz görüntüsü ile gösterilen nöronal izler boyunca belirgin şekilde ayrılmış punkta alanları seçilerek seçilir. Analiz için nöron başına en az beş ROI seçilir. Arka plan ROI'si, görüş alanının nörit içermeyen bir bölgesinde seçilir.
4. Aşağıdaki komut serisini kullanarak seçilen ROI'ler için zaman içindeki ham floresansı ölçün: Ölçme | Zaman ölçümü.
   1. Zaman Ölçümü panelinin üst kısmında Ölçüm işlevini başlatın. Zaman içindeki ham floresansın grafiksel bir temsili ve nicel verilerin her ikisi de oluşturulur.
      NOT: Her veri noktası, ölçülen belirli zaman noktasıyla ilişkili çerçeve için söz konusu ROI için ham floresansı temsil eder.
5. Ham floresan yoğunluklarını elektronik tablo yazılımına aktarın.

Tablo 1: Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) tamponlarının bileşimi.

Düşük KCL aCSF tamponu (pH 7.40 ila 7.45)
Reaktif	konsantrasyonu
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
Glikoz	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
Yüksek KCL aCSF tamponu (pH 7.40 ila 7.45)
Reaktif	konsantrasyonu
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50 mM
Glikoz	10 mM
CaCl2 2H2O	2
mM MgCl2 4H2O	1 mM

Malzemeler