Bir fare modelinde nöral aktiviteyi ve bağlantıyı incelemek için iki fotonlu holografik mikroskopi

Özet

Kaynak: Kato, D. et. al., İki Fotonlu Holografik Mikroskopi Kullanılarak Nöral Aktivitenin Değerlendirilmesi ve Manipülasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, holografik mikroskopi kullanılarak optogenetik ile birleştirilen iki fotonlu görüntüleme tekniğini göstermektedir. Uzamsal bir ışık modülatörü kullanan bu teknik, kırmızı ışığa duyarlı proteini ve kalsiyum görüntülemeyi minimum foto hasarla ifade eden hassas nöronal stimülasyon sağlar. Bu yaklaşım, sinir ağlarının işlevsel bağlantısı ve organizasyonu hakkında içgörüler sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kafa plakası implantasyonu (Şekil 1A)

1. Fareyi uyuşturmak için anestezik (74 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımı) intraperitoneal olarak uygulayın. Pedal reflekslerini değerlendirerek farenin anestezi durumunu sık sık kontrol edin.
2. Anesteziden sonra, fareyi stereotaksik bir alete yerleştirin. Kafa plakası implante edildiğinde korneanın kurumasını önlemek için bir göz merhemi sürün (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Cerrahi alanı tıraş edin ve cildi üç alternatif tur povidon-iyot veya klorheksidin fırçalayın ve ardından %70 alkollü mendil ile dezenfekte edin. Kafatasını dikkatlice ortaya çıkarın ve pamuklu çubuklarla temizleyin.
   NOT: Tüm cerrahi aletler sterilize edilmeli ve tüm işlemler buna göre yapılmalıdır. Kalan herhangi bir kalıntı (ör. saç veya kurumuş kan) enflamatuar reaksiyonlara neden olur. Bu nedenle, steril su veya% 70 alkol ile nemlendirilmiş pamuklu çubuklar kullanılarak herhangi bir kalıntı stereoskop altında çıkarılmalıdır.
4. Kraniotominin merkezini bulmak ve bir işaretleyici kalemle etiketlemek için stereotaktik koordinatları (anterior ve posterior = 0.5 mm, medial ve lateral = bregmadan 1.5 mm) kullanın.
5. Kafatasının ortasına özel yapım bir kafa plakası yerleştirin. Ardından, kafatasına sıkıca sabitlemek için diş çimentosu uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu). Kafa plakası kafatasının önü ve arkası ile sıkı bir şekilde temas edene kadar hafif basınç uygulayın.
   NOT: Bu adımın tamamlanması yaklaşık 20 dakika sürer ve iki fotonlu görüntüleme sırasında beyindeki hareket artefaktlarını azaltmak için kritik öneme sahiptir. Kafa plakasının boyutları 20 mm × 40 mm × 1 mm'dir ve bir kenarı 15 mm uzunluğunda, iki bitişik kenarı 3 mm uzunluğunda ve kalan iki kenarı 10 mm uzunluğunda bir ana plaka şekli açıklığı vardır.
6. Akrilik bazlı bir diş yapıştırıcı reçine simanını şu şekilde karıştırın: yarım kaşık toz, üç damla sıvı ve bir damla katalizör (bkz. Malzeme Tablosu). Kurumayı önlemek için, bu karışık diş yapıştırıcısı reçine çimentosunu kafa plakası ile farenin sağlam kafatası yüzeyine uygulayın.
7. Fareyi anesteziden çıkana kadar ılık bir kafese koyun. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın.

2. Cerrahi ve adeno-ilişkili virüs (AAV) enjeksiyonu (Şekil 1B)

1. Kafa plakası implantasyonundan 1 gün sonra diş yapıştırıcı reçine simanını kafatasından çıkarmadan kraniyotomi veya viral enjeksiyon yapın.
   NOT: Bu işlem sırasında fareye intraperitoneal olarak anestezi (74 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin karışımı) uygulayın.
2. Serebral ödemi önlemek için, ameliyattan 1 saat önce intraperitoneal olarak deksametazon sodyum fosfat (1.32 mg / kg) uygulayın.
3. Bir ısıtma yastığı ile vücut ısısını korurken bir buharlaştırıcı (anestezi dağıtım sistemi) kullanarak% 1 izofluran anestezisi ile fareyi kafa plakası ile uyuşturun. Kornea kurumasını önlemek için bir göz merhemi sürün.
4. Bir stereoskop altında, bir diş matkabı kullanarak yaklaşık 2 mm çapında dairesel bir kraniyotomi gerçekleştirin. Beyin hasarını azaltmak için, diş matkabını sürekli hafif hareket ve hafif aşağı doğru basınçla dikkatli bir şekilde çalıştırın.
5. Bir emme sistemi kullanarak kemik parçalarını birkaç kez çıkarın. Kemik parçalarını çıkardıktan sonra, beyin yüzeyinde kalan kalıntıları temizlemek ve yıkamak için yapay bir omurilik sıvısı (ACSF) solüsyonu kullanın. Enflamatuar reaksiyonları bastırmak için bu temizleme prosedürünü birkaç kez tekrarlayın.
   NOT: ACSF çözeltisi (140 mM sodyum klorür, NaCl, 2.5 mM potasyum klorür, KCl, 5 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit, HEPES, 2.0 mM kalsiyum klorür, CaCl₂ ve 1.0 mM magnezyum klorür, MgCl₂), reaktif çözüldükten ve süzüldükten sonra 1 ay boyunca 4 °C'de saklandı (gözenek boyutu = 0.22 μm).
6. Bir basınçlı enjeksiyon sistemi kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), uç çapı 10-20 μm olan bir cam kılcal damardan 500 nL AAV çözeltisi enjekte etmek için uygun basıncı (4 ms süreli darbelerde inç kare başına yaklaşık 10 Pound (PSI)) 10 dakika boyunca ayarlayın.
7. AAV çözeltisinin beyne uygulanıp uygulanmadığını belirleyin. cam kılcal damardaki AAV çözeltisinin seviyesinin kademeli olarak azalıp azalmadığının kontrol edilmesi.
8. Geri akışı önlemek için cam kılcal damarı 10 dakika daha yerinde bırakın. Beyne toplam 1.5 μL AAV çözeltisi uygulamak için üç kez tekrarlayın.
9. Katman 2/3 (L2/3) piramidal hücrelerdeki nöral aktiviteyi değerlendirmek ve manipüle etmek için bir AAV solüsyonu enjekte edin (Ca²⁺ görüntüleme için: 1.28 × 10¹⁴ vektör genomu/mL'de AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE, tuzlu suda 1:1 oranında seyreltilmiş; Ca²⁺ optogenetik ile görüntüleme: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE 1.73 × 10¹⁴ vektör genomu/mL, tuzlu suda 1: 1 oranında seyreltilmiş) vahşi tip farelerin birincil somatosensoriyel korteksinin arka pençe alanına (S1, bregmadan 0.5 mm posterior ve 1.5 mm lateral, yüzeyden 150 μm derinlikte ortalanmış).
   NOT: AAV solüsyonu, jGCaMP8f ve GCaMP6m-P2A-ChRmine ekspresyonu için görüntülemeden 2-3 hafta ve 1-2 hafta önce enjekte edilmelidir.
10. Bir mikropipet kullanarak S1'in beyin yüzeyine %2 (a/h) düşük erime noktalı agaroz uygulamasından sonra, iki kapak camı ile kraniotominin üzerine bir cam pencere yerleştirin. İki kapak camını (küçük 2,0 mm çap ve büyük 4,5 mm çap; bkz. Malzeme Tablosu) ultraviyole (UV) kürlenebilir yapıştırıcı ile takın.
11. Kapak camını hala sıvı haldeyken agaroza doğru bastırın; Bu, agarozda hava kabarcıklarının oluşumunu önler. Kraniyal pencerenin kenarlarını diş ve yapıştırıcı reçine çimentosu ile kapatın (Şekil 1C).
12. Fareyi stereotaksik aletten çıkarın ve kafesine geri koyun. Fareyi ılık bir kafese koyun ve anesteziden tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlarla birlikte kafese geri dönmeyin. Hayatta kalma ameliyatı sırasında steril koşulları dikkatli bir şekilde koruyun.
13. Ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca, genel davranışı gözlemleyerek farenin sağlık durumunu kontrol edin. Genel davranışta herhangi bir anormallik varsa, deri altına antienflamatuar ve analjezik ajanlar enjekte edin.

3. Holografik stimülasyon veya aydınlatma sistemi için hazırlık (Şekil 2)

1. Kırmızı bir floresan slaytın (dökme akrilik alt tabaka) yüzeyini numune düzlemine yerleştirerek holografik stimülasyon sistemini kalibre edin. Mikroskobu zayıf bir uyarma ışığıyla canlı görüntüleme moduna getirin ve calibration_GUI.m dosyasını çalıştırın. Parametreler panelini kontrol edin ve Save düğmesine tıklayın.
2. Adım 1 bölmesindeki Z Scan düğmesine tıklayın. 21 eksenel düzlemin tümünde, her düzlemden 2 μm uzakta olmak üzere otomatik olarak üç rastgele nokta oluşturacaktır.
3. Kaydırma çubuğunu hareket ettirin ve canlı görüntüyü kontrol edin. Noktaların en küçük ve en parlak göründüğü mükemmel bir düzlem bulun ve ardından Save düğmesini tıklayın. Bu, dijital hologram için otomatik olarak bir ofset küresel dalga cephesi oluşturur.
   NOT: En parlak floresan noktalarını bulamazsanız, tarama aralığının minimum ve maksimum değerlerini değiştirin ve tekrar deneyin.
4. Adım 2 bölmesindeki Go düğmesine tıklayın ve ardından sol karedeki altı noktayı tıklayın. Canlı görüntüyü kontrol edin. Altı ayırt edilebilir floresan noktası varsa, x ve y eksenlerini düzenleme kutularına yazın ve Save düğmesini tıklayın. Bu, holografik stimülasyon ve görüntüleme sistemi arasındaki kalibrasyonu koordine etmek için otomatik olarak afin dönüşüm katsayıları üretecektir.
   NOT: Eksen çifti numarası ve tıklanan nokta numarası sırayla eşleşmelidir. Emin değilseniz veya görüntünüzde hiç nokta yoksa, lütfen tekrar deneyin ve benzersiz bir nokta deseni oluşturun veya görüş alanının merkezi (FOV) çevresinde daha küçük bir aralık seçin.
5. Adım 3 bölmesindeki Scan düğmesine tıklayın. FOV boyunca 21 × 21 adımda tek nokta taraması gerçekleştirmek için 441 dijital hologram üretecektir.
   1. İlk olarak, liste kutusundaki desenleri değiştirirken görüntüleri kontrol edin. Ardından, görüntüleme cihazının dinamik aralığı dahilinde spot görüntüler elde etmek için lazer gücünü ayarlayın (örneğin, aşırı doygun görüntülerden kaçınmak için).
   2. Ardından, düzenleme kutusunda aralık süresini ayarlayın; Aralık süresi, kayıt aralığı süresinin iki katından fazla olmalıdır. Son olarak, görüntüleme cihazını kayıt moduna alın ve Play düğmesine tıklayın. Oynatma tamamlanırsa, komut penceresinde gösterilen "ekran Tamam" dizeleri olacaktır. Kaydı durdurun ve maksimum yoğunluk yöntemini kullanarak kaydedilen sıralı görüntüleri biriktirin.
6. Adım 4 bölmesinde WM Oluştur'a tıklayın ve yukarıdan yığılmış bir görüntü seçin. Ardından calibration_GUI penceresini kapatın. Her noktadaki dengesiz yoğunluğu telafi etmek için otomatik olarak bir ağırlık haritası oluşturacaktır.
   NOT: Daha detaylı bir açıklama için MATLAB kodunu buradan indirebilirsiniz (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Holografik aydınlatmalı bir görüntü sensörü kullanarak Ca²⁺ görüntüleme (Şekil 3)

1. AAV enjekte edilmiş fareyi bir kafa plakası ile mikroskop altına yerleştirin (Şekil 1D).
   NOT: Bu prosedür sırasında, fare uyanık durumda tutulur, ancak rahatsız edici uyaranlardan kaçabilir.
2. Holografik mikroskop ve 25x objektif ile 920 nm'ye ayarlanmış mod kilitli bir Ti: safir lazer kullanarak iki fotonlu görüntüleme (nokta tarama modu) gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Ticari görüntüleme yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Canlı görüntüleme modunda, jGCaMP8f ifade eden nöronların parlaklığını optimize etmek için görüntü dedektörünün voltajını (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntüleme lazerinin gücünü ayarlayın. Bu proteini ifade eden nöronların görüntülerini yakalayın.
   NOT: Görüntüleme lazerinin yoğunluğu (920 nm) 20-30 mW'dir. FOV, kortikal yüzeyden 100-150 μm derinlikte 512 μm × 512 μm idi.
4. jGCaMP8f'yi holografik aydınlatma ile ifade eden belirli nöronları aydınlatmak için SLMcontrol.m komut dosyasını çalıştırın. Referans Resmi tıklayın ve yukarıda alınan resmi seçin. Ardından, sürekli fare tıklamasıyla görüntüdeki nöronlardaki belirli pikselleri seçmek için Spot düğmesine tıklayın (Şekil 3A). Seçim tamamlandıysa, sonlandırmak için klavyedeki Enter düğmesine basın.
   NOT: Dijital hologram otomatik olarak hesaplanır ve uzamsal ışık modülatöründe (SLM) görüntülenir. Bu model, bir liste kutusuna tıklanarak da yeniden ziyaret edilebilir. SLM tarafından oluşturulan tek bir noktanın uzamsal çözünürlüğü, enine yön boyunca yaklaşık 1.2 μm ve optik eksen boyunca ~8.3 μm idi. Daha lokalize holografik stimülasyon elde etmek için yüksek sayısal açıklıklı (1.1) objektif lens kullandık.
5. Bir görüntü sensörü kullanarak yüksek zamansal çözünürlüğe sahip nöral aktiviteyi tespit etmek için (bkz. Malzeme Tablosu), görüntü alımını gerçekleştirmeden önce pozlama süresini, görüntüleme alanını ve gruplamayı ayarlayın (Şekil 3B) (Şekil 3C).
   NOT: Bir nöronu sürekli olarak uyaran holografik aydınlatma lazerinin (920 nm) yoğunluğu 2 mW'dir, bu da nöral aktiviteyi tespit etmek için yeterlidir. Örneğin, görüntüleme için 100 Hz'lik bir kare hızı elde etmek için pozlama süresi 9 ms, görüntüleme alanı 400 μm × 400 μm ve gruplama 4'tür.
6. Deneyden sonra, fareyi ev kafesine geri koyun.

5. Holografik mikroskop kullanarak optogenetik ile iki fotonlu görüntüleme (nokta tarama modu) (Şekil 4)

1. 4.1 ve 4.2 adımlarını tekrarlayın.
2. Ticari görüntüleme yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Canlı görüntüleme modunda, GCaMP6m-P2A-ChRmine eksprese eden nöronların parlaklığını optimize etmek için görüntü dedektörünün voltajını (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntüleme lazerinin gücünü ayarlayın. Bu proteinleri ifade eden nöronların görüntülerini yakalayın (Şekil 1E).
3. Adım 4.4'ü tekrarlayın.
4. L2/3 nöronları içindeki işlevsel bağlantıyı araştırmak için, optogenetik stimülasyonun holografik modellerini (ChRmine; 1.040 nm) oluşturmak için bir SLM kullanın ve bunu iki fotonlu Ca²⁺ görüntüleme (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 piksel, 2 Hz veya 30 Hz, 2x dijital yakınlaştırma, nokta tarama modu; Şekil 3D-H).
   1. Bu protokol için, görüntüleme lazerinin yoğunluğunu 10-20 mW'de 920 nm'ye ve FOV'u kortikal yüzeyden 100-150 μm derinlikte ölçülen 256 μm × 256 μm olarak ayarlayın. Piksel bekleme süresini 2 Hz için 1,5 μs veya 30 Hz için 100 ns olarak ayarlayın.
   2. Tek bir holografik uyaranın nöronlarda kalsiyum tepkisine neden olup olmadığını görmek için görüntüleme kare hızı olarak hem 2 Hz hem de 30 Hz kullanın. Tek bir nöronu 10 mW'da uyaran holografik stimülasyon lazerinin (1.040 nm) yoğunluğunu ayarlayın, bu da nöral aktiviteyi indüklemek için yeterlidir (Şekil 3D).
      NOT: SLM tarafından oluşturulan tek bir noktanın uzamsal çözünürlüğü, enine yön boyunca yaklaşık 1.2 μm ve optik eksen boyunca ~8.3 μm'dir. Yanal yönde erişilebilir hacim aralığı yaklaşık 500 μm × eksenel yönde 500 μm ve 100 μm'dir. 2 Hz veya 30 Hz görüntüleme kare hızında Ca²⁺ görüntüleme ile sadece bir nöronun değil, birden fazla nöronun aynı anda holografik olarak uyarılabileceğini daha da doğruladık (Şekil 3E).
5. Aşağıdaki protokolle görüntü alımını gerçekleştirin: Ca²⁺ yanıtını 920 nm'de 10 holografik uyaranla 1.040 nm'de 8 saniye aralıklarla (0.125 Hz) 10 saniyelik bir başlangıç süresinden sonra 50 ms'lik bir süre boyunca aynı anda görüntüleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Deneysel prosedürün şematik taslağı. (A) Kafa plakasının kafatasına sabitlenmesi. (B) AAV'nin primer somatosensoriyel korteksin (S1HL) arka pençe bölgesine stereotaktik enjeksiyonu. (C) Kraniyal...

Malzemeler