Bir farenin gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemesi Bir miniskop kullanarak medial prefrontal korteks

Özet

Kaynak: Thapa, R., et. al., Derin Beyin için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Gradyan İndeksli Lens İmplantasyonu In Vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2021)

Video, transdüksiyonlu bir farede bir miniskop kullanarak nöronal aktiviteyi davranışla ilişkilendiren gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir.

Protokol

Minoskop montajı ve in vivo Ca²⁺ görüntüleme (Şekil 1)

1. Miniskopu tabanına monte edin
   1. Fareyi indüksiyon odasında kısa bir süre uyuşturun (%5 izofluran ve 1 L/dk oksijen akış hızı). Fareyi temiz bir tezgah yüzeyine yerleştirin.
   2. Kilitleme vidasını küçük bir tornavidayla gevşetin, koruyucu kapağı çıkarın ve GRIN (Gradyan indeksli lens) lensin yüzeyini asetonla ıslatılmış bir pamuklu çubukla temizleyin.
   3. Minyoskop ipliğinin etrafına bir PTFE bant (Politetrafloroetilen bant) sıkıca sarın ve miniskopu fare kafasındaki tabanına sabitleyin.
   4. Miniskopu kabloya bağlayın (Şekil 2K) ve NeuView Yazılımı.
   5. NeuView'da Donanım'a tıklayın, LED1'i işaretleyin ve canlı görüntüleri görüntülemek için Akış düğmesine tıklayın (Şekil 3A).
   6. Künt forseps yardımıyla hafifçe sıkarak veya gevşeterek, miniskopun tabana göre konumunu ayarlayarak en iyi odak düzlemini belirleyin.
      NOT: En iyi odak düzlemi, birkaç olası konumu karşılaştırarak ve çoğu hücre gövdesinin net bir şekilde görselleştirilmesiyle belirlenir.
   7. Kilitleme vidasını sıkın ve fareyi ev kafesine geri yerleştirin.
   8. NeuView'da LED ışık gücünü optimum seviyeye ayarlayın. Kaydı başlatmak için Yakala'ya ve ardından Tetik düğmelerine tıklayın ve 150 kare sonra Durdur'a basın.
      NOT: Mümkün olan en düşük güç, yeterince parlak bir görüntü elde etmek için LED gücünün en uygun seviyesini belirler. Kısa bir video kaydetmenin amacı, gelecekte tekrarlayan görüntüleme için aynı odak düzlemini tanımlamayı kolaylaştırmaktır.
   9. Kabloyu miniskoptan çıkarın. Deneye başlamadan önce farenin en az 30 dakika iyileşmesine izin verin.
      NOT: Minoskopu korumak için, tipik olarak, bu kısa süre içinde su şişesi ve tel yiyecek besleyici çıkarılır. Farenin ev kafesinde daha uzun süre kalması gerekiyorsa, ev kafesinde ticari olarak temin edilebilen diyet jeli (Malzeme Tablosuna bakınız) temin edilmesi önerilir.
2. İn vivo kalsiyum görüntüleme için veri toplama
   NOT: İn vivo olarak, kalsiyum görüntüleme, araştırmacının istediği herhangi bir davranış testi ile birlikte eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Gösterim amacıyla, buradaki örnek, bir açık alan testi sırasında in vivo Ca²⁺ görüntülemedir. Bu amacı gerçekleştirmek için iki bilgisayar gereklidir. Bir bilgisayar, fare davranışını otomatik olarak kaydetmek üzere bir kamerayı kontrol etmek için ticari yazılımla donatılmıştır (Malzeme Tablosuna bakın). Diğer bilgisayar, miniskopu kontrol etmek ve Ca²⁺ görüntülerini kaydetmek için NeuView ile donatılmıştır.
   1. Canlı Akış işlevi aracılığıyla fare davranış alanını görüntülemek için davranış kamerası yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Üst kameranın odağını manuel olarak ayarlayın (Şekil 2L).
   2. Tetik/Flaş'ı seçin ve "Tetiği Etkinleştir/Devre Dışı Bırak" seçeneğini işaretleyin (Şekil 3B). Kayıt düğmesine tıklayın, davranış kayıtlarının kaydedileceği konumu seçmek için Gözat'ı kullanın ve istediğiniz görüntü formatını seçin.
      NOT: "Tetik Kontrolü" işlevi, davranış kaydının NeuView yazılımı tarafından tetiklenmesine izin vermek için etkinleştirilmiştir, böylece davranış çerçeveleri ve karşılık gelen kalsiyum görüntüleme çerçeveleri geçici olarak birbirine bağlanır. Davranış kaydı istenen herhangi bir formatta kaydedilebilir. Davranış kaydı genellikle belirlenen klasöre JPEG formatında kaydedilir.
   3. Fareyi arenaya yaklaştırın ve miniskopu Veri Toplama Sistemine bağlı kabloya bağlayın (Şekil 2L) (bkz. Malzeme Tablosu). Fare daha sonra arenanın ortasına yerleştirilir.
   4. NeuView yazılımının Canlı Yayın işleviyle, kalsiyum görüntünün parlaklığını optimize etmek için LED gücünü ayarlayın.
      NOT: Kalsiyum görüntüleme için, kayıt kare hızı varsayılan olarak 10 kare/sn'dir.
   5. NeuView'da LED1'in işaretini kaldırın, Yakala'ya tıklayın ve ardından kayda başlamak için Tetik düğmelerine tıklayın ve 100 kare sonra Durdur'a basın.
      NOT: Bu, LED ışıkları kapalıyken yaklaşık 100 kare boyunca arka plan görüntüleri kaydetmek içindir.
   6. Davranış kamerası yazılımında, Kaydı Başlat'a tıklayın (Şekil 3C). NeuView'da LED1'i kontrol edin, Yakala'ya tıklayın ve ardından kayda başlamak için Tetik düğmelerine tıklayın. 3000 kare sonra Durdur'a basın.
      NOT: Bu, kalsiyum görüntülemeyi ve davranışı aynı anda kaydetmek içindir. Açık alan testi 15 dakika uzunluğundadır ve tipik olarak her biri 5 dakikalık üç kayıt oturumuna bölünür. Bu, sürekli kullanım nedeniyle miniskopun aşırı ısınmasını önlemek içindir.
   7. Hem kalsiyum görüntüleme hem de davranış kayıtlarını belirlenen klasörlere kaydedin. Her oturumdan önce arka planı kaydederken kaydı iki oturum daha tekrarlayın ve tüm kayıtları belirlenen klasöre kaydedin.

Sonuçlar

Şekil 1: Deneysel prosedürün şematik genel bakışı. (A) mPFC'de (medial Prefrontal Korteks) virüsün stereotaksik enjeksiyonu. (B) mPFC'de GRIN (Gradyan indeksli lens) lens implantasyonu. (C) M...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aseton	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN lens temizleyici
Davranış Yeniden Kodlama Yazılımı (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	Davranışı kaydetmek için
Veri toplama denetleyici	NIDA/IRP	Özel olarak tasarlanmış	Görüntü toplama sistemi bileşeni
Veri iletim kablosu	NIDA/IRP	Özel tasarlanmış	Görüntü elde etme sistemi
bileşeni GRIN lens	lens implantasyonu için	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S
Minoskop tabanı	Protolabs	Tabanı	özel olarak tasarlanmış
tutma kolu	NIDA/IRP	Tabanı monte etmek için	özel olarak tasarlanmış
Miniskop koruma kapağı	Protolabs	Miniskopu korumak için	özel olarak tasarlanmıştır
Motorlu kontrolör	Thorlabs	KMTS50E	Tabanı monte etmek için
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	İn vivo görüntüleme için
Oftalmik merhem	Puralube Vet Merhem	NDC 17033-211-38	Oftalmik
Politetrafloroetilen (PTFE) bant	TegaSeal PTFE Bant	AA-58092	MiniScope'u tabana sabitlemek için
Steril pamuklu çubuk	Puritan	REF 806-WC	Her iki ameliyat için

GRIN Miniskop montajı için