$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hızlandırılmış Görüntüleme için Mikroskop Kurulumu
1. Lazer ayarlarını belirleme
1. Kullanılacak lazer dalga boyunun belirlenmesi. İlgilenilen floroforun uyarma dalga boyunun iki katı olan bir dalga boyu kullanın (örneğin, yeşil floresan proteini (GFP) için 880 ile 940 nm arasındaki dalga boyu.
NOT: Bu çalışmada, GFP için dalga boyu ayarı 880 ile 940 nm arasındaydı. Dalga boyu ne kadar yüksek olursa, lazerin çıkış gücü o kadar düşük olur.
2. Lazer iletimini belirleyin. Lazer iletiminin yüksek bir yüzdesi embriyoyu öldürür, en düşük iletim seviyesini kullanır (önerilir). Burada sunulduğu gibi 24 ila 48 saatlik hızlandırılmış çalışmalar için iletimi %5'in altında tutun.
3. Mikroskop algılama sistemlerini belirleyin ve florofor için doğru filtrelerin yerinde olduğundan emin olun.
NOT: Çok fotonlu mikroskoplar için, yayılan floresan için çeşitli hassasiyetlere sahip çoklu algılama sistemleri vardır. Genel olarak, bir dahili algılama sistemi, harici bir algılama sisteminden daha az hassasiyete sahiptir. Yüksek düzeyde GFP ekspresyonuna sahip transgenik hatlar için dahili algılama sistemi yeterlidir. Düşük GFP ekspresyonu seviyelerine sahip transgenik hatlar veya diğer floroforlar (örneğin, kırmızı floresan proteini) için, lazer iletiminin yüzdesini makul bir seviyede tutmak için harici bir algılama sistemi gerekebilir. Kullanılan algılama sistemi ne olursa olsun, florofor için doğru filtreler yerinde olmalıdır.
2. Çoklu foton mikroskobunda yazılım ayarlarını yapma
1. 5X objektifini kullanarak embriyoyu bulun. Sahneyi manuel olarak en yüksek konuma kaldırın ve embriyoyu mikroskop aralığının ortasına yerleştirmek için ince odağı kullanın.
2. Sahneyi manuel olarak indirin ve 5X hedefini 25X suya daldırma objektifine değiştirin (sayısal diyafram NA, 0,95). Embriyoyu tekrar odak noktasına getirmek için sahneyi dikkatlice yükseltin.
3. Yazılımda, "z" derinliğinde xy düzleminde zaman aralıklarında (t) birden fazla görüntü elde etmek için "xyzt" moduna tıklayın. Z yığınını sınırlayacak olan ilgilenilen alandaki odak derinliğini bulmak için epifloresan veya parlak alan görünümünü kullanın.
1. Yazılımda "başlat" düğmesine tıklayın; Bu deneyler için, gözün yan kenarı Z yığınının başlangıcıydı. "Bitir" düğmesine tıklayın; embriyonun orta hattı Z-yığınının sonuydu.
NOT: Adım boyutu 0.3-0.6 μm idi ve 60 ila 120 μm'lik bir z-yığını boyutu için toplam ~ 200 adım vardı).
4. Çekim süresini ve görüntüleme frekansını ayarlamak için menüye tıklayın.
Mevcut sistem için, ~200 adım, her z-stack alımı için yaklaşık 5 dakika gerektirir. Floroforun yeterli şekilde geri kazanılması ve embriyonun hayatta kalması için, z-yığını alımı (lazerin açılması açık) ve geri kazanım süresi (lazerin kapanması) arasında en az 1:3'lük bir orana izin verin.
NOT: Örneğin, z-yığınları, 5 dakikalık z-yığını alımı ve 15 dakikalık kurtarma ile her 20 dakikada bir elde edilir. Bu protokol için, daha büyük z-yığınları elde edilebilir, ancak z-yığını alımları arasındaki süreyi uygun şekilde artıracak ve hızlandırılmış rota boyunca daha az görüntü ile sonuçlanacaktır.
1. Embriyo iyileşmesi için uygun zamanla, belirlenen pencerede z-yığınları arasındaki süreyi ayarlayın. Uygun pencerede deneme için toplam süreyi ayarlayın.
5. Son yazılım, lazer ve embriyo ayarlamaları.
1. Lazer ayarlarında son ayarlamaları yapmak için canlı görüntü ayarını açın. Floresan görüntüyü optimize etmek için yazılım içinde lazer iletimini, kazancı ve ofset kaydırma çubuklarını ayarlayın. Ayrıca, deneyin uzunluğuna, embriyonun beklenen büyümesine vb. bağlı olarak embriyonun yönünü gerektiği gibi ayarlayın. İlgi alanının, deney süresi boyunca çerçeve içinde kaldığından emin olun.
2. Hızlandırılmış çekim sırasında artık gerekli olmadığı için epifloresan ışık kaynağını kapatın. S'yi örtüntage, lazer güvenlik kutusu ile (Şekil 1I). Dahili algılama sistemini kullanırken, lazer güvenlik kutusu arka plan ışığına karşı koruma için yeterlidir. "Başlat"a basın.
NOT: Ancak, daha hassas harici algılama sistemlerinde, lazer güvenlik kutusu yeterli arka plan ışığını engellemez ve görüntü alımının bozulmasını önlemek için ek kapaklar gerekir.
2. Hızlandırılmış Alım Sırasında
1. Lazer güvenlik kutusundaki kayar kapılardan hızlandırılmış çekim sırasında açık banyo odasını her 8-12 saatte bir (günde en az 2 kez) hızlandırılmış embriyo ortamı ile yeniden doldurun (Şekil 1I).
2. Lazer güvenlik kutusunun kapılarını açmadan önce, mikroskobun aktif olarak bir görüntü almadığından emin olun.
NOT: 24 ila 48 saat süren hızlandırılmış görüntüleme deneyleri için ısıtıcıların ve sirkülasyonlu ortam sistemlerinin kullanılması gerekli değildir. Gerçekten de, hem kademeli hem de sıralı ısıtıcıların sıcaklıklarını kontrol etmek zordur ve görüntü elde etme sırasında embriyo, 25-28 ° C arasındaki bir sıcaklık aralığında yeterli bir gelişme hızı sergiler. Ayrıca, dolaşımdaki medya sistemleri taşma ve ekipmana potansiyel olarak zarar verme eğilimindedir. Bu nedenle, tüm embriyolar edinim sonrası rutin olarak evrelendirilir.
3. Edinme sonrası işleme
1. Yazılımda, "dosya" menüsüne tıklayın ve "kaydet" i seçin.
2. Dosyayı görüntü işleme yazılımında açın (Malzeme Tablosuna bakın). Doğru görüntü serisini vurgulayın. Yazılımda, "İşlem" menüsünü seçin. 3D Deconvolution'a tıklayın ve her bir z-stack.
NOT: Dosya büyük; Bu nedenle, bu adım birkaç saat sürebilir.
3. Yazılımda, "İşlem" menüsü altında "maksimum projeksiyon"a tıklayın. Z yığını başına 1 görüntü oluşturmak üzere maksimum projeksiyonu başlatmak için "Uygula"ya tıklayın. Yansıtılan her maksimum dosyayı (z-yığını başına 1 görüntü) tiff olarak dışa aktarın.
4. Tek tek tiff dosyalarını video işleme yazılımına aktarın. Tüm tiff dosyalarını seçin ve video düzenleyiciye sürükleyin. Videodaki her görüntünün uzunluğunu 0.1 saniye olarak ayarlayın. Videoyu mov veya mp4 dosyası olarak dışa aktarın.
