Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

Abstract

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Protocol

1. Hazırlık

1. 0.5 g sığır serum albümini (BSA) ve 0.5 mL t-Oktilfenoksipolietoksietanol (PBT) çözeltisi ile 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL 1X PBS'ye ve en az 30 dakika karıştırın. 4 °C'de saklayın. Nispeten taze olduğunda kullanın ve solüsyonu temiz bir şişede saklayın.
2. 6.5 mL deiyonize suya 2.5 mL %16 stok paraformaldehit çözeltisi ve 1 mL 10x PBS ekleyerek 10 mL %4 paraformaldehit yapın. 4 °C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
   DİKKAT: Paraformaldehit çözeltisi ile cilt temasından kaçının çünkü oldukça toksiktir.
3. 1 mL DMSO başına 0.1 g X-Gal substratını çözerek 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-Gal) substratı (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde% 10 w/v X-Gal) yapın. -20 °C'de 100 μL'lik alikotlarda saklayın.
4. 10 mM fosfat tamponu (pH 7.2), 150 mM sodyum klorür, NaCl, 1 mM magnezyum klorür, MgCl₂, 3 mM potasyum ferrosiyanür, K₄[FeII(CN)₆], 3 mM potasyum ferrisiyanür, K₃[FeIII(CN)₆], ve% 0.3 t-Oktilfenoksipolietoksietanol. Karanlıkta 4 °C'de saklayın.
5. %30 stok hidrojen peroksiti 1:10 oranında deiyonize su ile seyrelterek %3 hidrojen peroksit çözeltisi hazırlayın.
6. 1 tablet (10 mg) DAB'ı 35 mL taze PBT çözeltisi içinde tamamen çözerek 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi yapın. 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve -20 °C'de 910 μL'lik alikotlarda saklayın.
   DİKKAT: DAB'ı yok etmek için tüm DAB atıklarını çamaşır suyuna atın.
7. Elma suyu ile yumurta tabakları yapın. 2 L'lik bir şişeye 35 g agar ve 1 L deiyonize su ekleyin. 1 L'lik bir şişeye 33 g sükroz, 2 g tegosept ve 375 mL elma suyu ekleyin. 30 dakika otoklavlayarak eritin. Her iki çözeltinin de yaklaşık 60 °C'ye soğumasını bekleyin. Bu çözeltileri karıştırarak iyice birleştirin ve karıştırın. 60 mm kültür kabı başına ~ 11 mL kombine çözelti dökün.
8. Ekmek mayasını deiyonize suya (1:0.8 oranında) karıştırarak maya ezmesi yapın ve 4 °C'de saklayın.

2. Embriyo Toplama (1. Gün)

1. Genç dişi ve erkek sinekleri (5 günden küçük) toplayın ve 1-2 gün boyunca, ortasında az miktarda maya macunu bulunan bir yumurta tabağı (60 mm x 15 mm) olan plastik bir beher kafesinde saklayın.
2. Geç evre 16 embriyoların en iyi şekilde toplanması için, saat 17:00 civarında sineklerle (> 50) bir şişe kafesi kurun ve 25 °C'de 3 saat boyunca yumurtlamalarına izin verin.
3. Sinekleri taze bir gıda şişesine aktarın.
4. Yumurta plakasını kapakla kapatın ve gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde (~%70 nem) 25 °C'de baş aşağı inkübe edin.

3. İmmün Boyama için Embriyoların Hazırlanması (2. Gün)

1. Saat 10:20 civarında yumurta tabağına 1.8 mL PBT solüsyonu ekleyin ve embriyoları plakadan gevşetmek için pamuklu çubuk kullanın.
   NOT: Maya hamurunu pamuklu çubuk kullanarak nazikçe ezerek, üzerinde çok sayıda embriyo bulunması ihtimaline karşı eritin. Embriyoları fiksasyondan ~ 40 dakika önce (yaklaşık 11:00 AM) toplamaya başlayın.
2. Embriyoları yumurta plakasından 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
3. Embriyoların yerleşmesine izin verin ve PBT solüsyonunu mümkün olduğunca aspire edin. Embriyoları 1 mL PBT çözeltisi ile iki kez durulayın. PBT solüsyonunu mümkün olduğunca aspire edin.
4. Tüpü 1 mL %50 çamaşır suyu (yani deiyonize suda seyreltilmiş) ile doldurun ve embriyoları oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca bir nutatör üzerinde inkübe ederek dekoryonlayın.
   NOT: Bu adım, dekoryona uğramış embriyoları öldürmez.
5. Dekoryonlu embriyoların yerleşmesine izin verin,% 50 ağartıcıyı mümkün olduğunca aspire edin ve embriyoları 1 mL PBT solüsyonu ile 3 kez durulayın.
6. 0.5 mL heptan ekleyin ve ardından RT'de saat 11:00 civarında tüpe 0.5 mL %4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin.
7. Embriyoları RT'de 15 dakika boyunca bir nutatör üzerinde inkübe edin.
8. % 4 paraformaldehit çözeltisini (alt katman) çıkarın.
9. 0,5 mL %100 metanol ekleyin ve tüpü 30 saniye kuvvetlice çalkalayarak embriyoları devitellinize edin.
10. Heptanı çıkarın (yani, üst katman).
11. 0,5 mL %100 metanol ekleyin ve tüpü 10 saniye kuvvetlice çalkalayın.
12. Tüpe vurarak embriyoların yerleşmesine izin verin ve metanolü mümkün olduğunca aspire edin. Embriyoları 1 mL %100 metanol ile durulayın, 10 saniyeden daha az çalkalayın.
    NOT: Metanole uzun süre maruz kalmak β-Gal aktivitesini yok eder.
13. Metanolü çıkarın ve devitellinize embriyoları 1 mL PBT solüsyonu ile 3 kez durulayın.

4. LacZ Boyama Kullanarak Embriyoların Genotiplenmesi (2. Gün)

1. Tüpe 1 mL PBT çözeltisi ekleyin ve tüpü 37 °C'lik bir ısı bloğunda veya su banyosunda 15 dakika inkübe edin.
2. İnkübasyon sırasında, X-Gal boyama solüsyonunu (tüp başına 1 mL) 65 °C'de hava bulanıklaşana kadar bir su banyosuna yerleştirin. 37 °C su banyosunda inkübe edin.
3. PBT solüsyonunu aspire edin ve tüpe 1 mL X-Gal boyama solüsyonu ve 20 μL X-Gal substratı ekleyin.
4. Tüpü 37 ° C'de mavi bir çökelti belirginleşene kadar nutasyon ile inkübe edin.
   NOT: 2. ve 3. mavi dengeleyiciler için kuluçka süresi genel olarak 2-4 saat arasında değişir.
5. X-Gal boyama solüsyonunu çıkarın ve embriyoları 1 mL RT PBT solüsyonu ile 3 kez durulayın.
6. Bir iğne probu veya forseps kullanarak, istenen genotipteki embriyoları (yani, lekelenmemiş beyaz embriyolar) bir ışık diseksiyon mikroskobu (1.6X-2.5X objektif) ile elle sıralayın.
   NOT: CyO, aktin-LacZ ve TM3, aktin-LacZ gibi bazı mavi dengeleyiciler, aktin promotörün kontrolü altında bakteriyel β-Gal (LacZ) eksprese eden transgenik bir yapı taşıdığından, her yerde bulunan maviye boyanmış embriyolar, mavi dengeleyici kromozomların bir veya iki kopyasını içerir. Bu nedenle, lekelenmemiş beyaz embriyolar istenen öldürücü alel için homozigottur.

5. Anti-Fasiklin II Antikorları ile Embriyoların İmmün Boyanması (2-3. Gün)

1. İstenilen genotipteki embriyoları toplayın ve aktarın (yani, lekelenmemiş beyaz embriyolar) 1 mL pipet ucu kullanarak 0.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
   NOT: Bu adımda, embriyolar, kütikülün segmentasyon paternleri ve baş ve kuyruk yapıları dahil olmak üzere morfolojik kriterlere göre kabaca evrelendirilebilir. Kafa involüsyonu sırasında, yumurtalar bırakıldıktan 10 ila 16 saat sonra, embriyo ön segmentte belirgin bir azalmaya uğrar.
2. Embriyoları bir kez 0.4 mL PBT solüsyonu ile yıkayın ve 0.3 mL bloke edici solüsyon ekleyin (PBT solüsyonunda %5 normal keçi serumu ve %5 DMSO).
3. Embriyoları RT'de 15 dakika boyunca nutasyon ile bloke edin.
4. 75 μL anti-Fasiclin II antikoru ekleyin ve tüpü gece boyunca RT'de nutasyon ile inkübe edin.
5. Embriyoları yıkama başına en az 20 dakika boyunca 0.4 mL PBT solüsyonu ile 4 kez yıkayın.
6. Keçi anti-fare-yaban turpu peroksidaz (anti-fare-HRP) antikoru (2 μg / mL) içeren 0.3 mL bloke edici çözelti (PBT çözeltisinde% 5 normal keçi serumu) ekleyin ve tüpü gece boyunca RT'de nutasyon ile inkübe edin.
7. Embriyoları yıkama başına en az 20 dakika boyunca 0.4 mL PBT solüsyonu ile 6 kez yıkayın.
8. Tüpe 0.3 mL DAB çözeltisi ekleyin.
   DİKKAT: Eldiven giyin ve tüm DAB atıklarını/tüplerini/uçlarını çamaşır suyuna koyun.
9. 2 μL% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve istenen miktarda çökelti üretilene kadar tüpü karanlıkta RT'de nütasyon ile inkübe edin.
   NOT: Genel olarak 1D4 immünohistokimyası için kuluçka süresi 0.5-1 saat arasında değişir.
10. Embriyoları 0.4 mL PBT solüsyonu ile 4 kez yıkayın.
    DİKKAT: DAB solüsyonunu ve ilk iki yıkamayı bir pipetle çıkarın ve çamaşır suyuna atın.
11. Tüpe 0,2 mL montajlı %70 gliserol/PBS solüsyonu ekleyin ve RT veya 4 °C'de saklayın.
    NOT: Tüpü ışıktan uzak tutun. Embriyoları %90 gliserol/PBS solüsyonuna yerleştirerek daha net preparatlar elde edilebilir. Bununla birlikte, %90 gliserol/PBS solüsyonunda temizlenen embriyoları diseksiyon etmek, %70 gliserol/PBS solüsyonunda temizlenenlere göre daha zordur.

6. Embriyoların Evrelenmesi, Diseksiyonu, Montajı ve Görüntülenmesi (4. Gün)

1. Evreleme için, %70 gliserol/PBS ile dengelenmiş embriyoları bir cam lam üzerine aktarın.
2. Abdominal segment 7 (A7), A8 ve A9 intersegmental sinir (ISN) sinirleri birbirine temas etmek için birleşen ve/veya üç banda bölünmüş orta bağırsağa sahip geç evre 16 embriyoları toplayın.
   NOT: 1D4 antikoru ile boyanan embriyolar, ISN ve ISNb motor aksonlarının projeksiyon modellerine göre evrelendirilebilir. Merkezi sinir sisteminden (MSS) çıktıktan sonra, geç evre-16 embriyoların A7, A8 ve A9 ISN sinirleri birbirine dokunmak için birleşir ve daha sonra sırt kaslarına kadar uzanmak için ayrılır (Şekil 1A'daki ok ucu). Bununla birlikte, orta evre 16 embriyolarda, A7 ISN sinirleri, A8/A9 sinirlerine paralel olarak uzanır (Şekil 1B'de köşeli parantez). Ek olarak, her iki hemisegmentteki A6 ISNb sinirlerinin (ventrolateral kaslara dik) projeksiyon eksenleri, CNS longitudinal akson fasiküllerinin arka ucu ile kabaca hizalanmıştır (oklar ve Şekil 1C'deki bir çizgi). Bu morfolojik kriterler farklı genotipler arasında farklılık gösterir. Alternatif olarak, embriyolar bağırsak morfolojisine göre sahnelenebilir. 17. aşamadan önce, orta bağırsak kalp benzeri bir şekle sahipken, orta bağırsak 17. aşamada üç gruba bölünür.
3. Embriyoları inceleyin.
   1. 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, her embriyoyu gliserol damlasından çıkarın ve embriyoyu ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Vücut uzunluğunun 1 / 4'ü oranında ön kısmı ve motor aksonlardan arınmış en arka bölgeyi kesin.
   2. Bir iğne probu kullanarak, uç kesilmiş embriyoyu gliserol damlasından çıkarın, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yuvarlayın ve alana yatay olarak yerleştirin.
      NOT: Embriyo gliserol damlasından dışarı çıkarıldığında, embriyo ile ilişkili bir miktar gliserol onu yapışkan hale getirir.
   3. Tek bir çok ince tungsten iğnesi kullanarak embriyoyu dorsal orta hat boyunca kesin. Embriyonun arka ucunda küçük bir kesi yapın ve ardından dorsal orta hattı öne doğru kesmeye devam edin; Ters yönde kesmek de iyidir.
   4. Bir iğne probu kullanarak, orta hat kesimli embriyoyu gliserol damlasına hareket ettirin, sırt tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve her vücut duvarını ventrolateral (diyagonal) bir yönde (2.5X objektif) açarak bağırsağı vücut duvarından ayırın.
      NOT: Sırt orta hattının tamamen kesildiğinden emin olun, bu da sol ve sağ vücut duvarları arasında tam bir ayrım sağlar.
   5. Orta hat kesimli embriyoyu dikkatlice gliserol damlasından çıkarın ve ardından ince bir iğne probu (2.5X objektif) kullanarak vücut duvarının iki kanadını cam slayt üzerine yerleştirin.
   6. Çok ince bir tungsten iğnesi kullanarak, iç organları yanal olarak iterek diseke edilmiş embriyodan çıkarın (5X objektif).
      NOT: Benzer başka bir diseksiyon işleminin daha ayrıntılı bir açıklaması web sitesinde bulunabilir.
4. Montaj için, temiz, diseke edilmiş embriyolara 2-3 μL %70 gliserol/PBS solüsyonu ekleyin ve ince bir iğne probu kullanarak, üzerine 8 μL %70 gliserol/PBS solüsyonunun merkezde yayıldığı yeni bir cam slayta aktarın (2.5X objektif).
5. Bir lamel (18 mm x 18 mm) giyin. Lamelin kenarlarını normal oje ile kapatın (şeffaf veya renkli iyidir).
6. Üreticinin talimatlarına göre diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ışık mikroskobu altında yüksek çözünürlükte (20X, 40X ve 63X yağa daldırma objektifleri) görüntüler yakalayın.
   NOT: Özellikle ISNb motor aksonları için daha iyi görselleştirme ve fenotipik karakterizasyon, 63X yağa daldırma objektifi kullanılarak üretilebilir.

Results

Şekil 1: ISN ve ISNb motor aksonlarının projeksiyon modellerine dayalı olarak embriyoların evrelendirilmesi. (A) Geç evre 16 vahşi tip embriyolarda, A7, A8 ve A9 ISN sinirleri (oklar) birbirine dokunmak için birleşir (ok ucu). Anterior so...

Materials