Serebellar Nöronları Görselleştirmek için Zebra Balığı Larva Beyninin İn Vivo Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Schramm, P. et al. Uyanık Zebra Balığı Larvalarında ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun Kafatası ve Deri Çıkarma ile İn vivo Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, Purkinje nöronlarında floresan proteinleri eksprese eden transgenik zebra balığı larvalarındaki serebellar nöronların in vivo görüntülemesini göstermektedir. İşlem, larvaların uyuşturulmasını, agarozda hareketsiz hale getirilmesini ve ışık penetrasyonunu ve floresan yoğunluğunu artırmak için pigmentli cildin dikkatlice çıkarılmasını içerir. Son olarak, hazırlanan örnekler, etiketli nöronları net bir şekilde görselleştirmek için konfokal bir mikroskop altında görüntülenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Anesthesia of larvae and preparations for embedding
   1. Gün için deneye başlarken, plastik bir Pasteur pipeti ile ihtiyaç duyulan hayvanları 90 mm çapında bir Petri kabına aktarın, bu da Danieau (Danieau ile bir Petri kabında hala tutulan larvalar için) veya balık tesisinden su (döllenmeden 7 gün sonra [dpf] daha eski olan ve tutulan larvalar için) ile doldurulur. balık tesisinde).
      1. 2 haftadan eski balıkları pipetlerken, pipetin açıklığının, balıkları aktarırken balıkları yaralamamak için yeterince büyük olduğundan emin olun. Ağ kullanmayın çünkü balıklara, özellikle de genç larvalara fiziksel olarak zarar verir.
   2. Yiyeceklere serbest erişim ve larvaların maksimum sağlık durumunu sağlamak ve stresi azaltmak için Petri kabında tutulan larvaların boyutuna uygun rotifera veya artemia nauplii ekleyin.
   3. Gömmek için, seçilen larvaları yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile doldurulmuş 35 mm çapında bir Petri kabına aktarın. 10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna / etkili doza ulaşmak için gerekli hacimde d-Tubocurarine ekleyin ve larvalar tamamen hareketsiz hale gelene kadar birkaç dakika bekleyin.
      NOT: Balıklar yaşlandığında veya daha hızlı bir tam anestezi gerekiyorsa (5 dakikanın altında), d-Tubocurarine konsantrasyonunu artırmak mümkündür (fareler için LD50 intravenöz olarak 0.13 mg / kg'dır). Kürare ile aynı etkiye sahip olan ve aynı zamanda beyni tamamen aktif tutan α-bungarotoksin (çalışma konsantrasyonu: 1 mg / mL) gibi farklı bir anestezik kullanmak da mümkündür. İlgilenilen konu için tamamen aktif bir beyin gerekli değilse, öldürücü olmayan bir dozda (% 0.02) Trikain de larvaları tamamen uyuşturmak için bir seçenektir. Bununla birlikte, Trikain sodyum kanallarını bloke ederek beyin aktivitesini bozar.
   4. 35 mm çapındaki Petri kabının kapağını alarak montaj haznesini hazırlayın, kapağı ters çevirin ve kapağın alt kısmına kare şeklinde bir cam lamel (24 x 24 mm) yerleştirin. Bu adımların şematik açıklaması için Şekil 1'e (üst kısım) bakın. Camın daha pürüzsüz yüzeyi, kafatası açma işlemi sırasında larvaları içeren agaroz bloğunun kaymasını önler.
   5. Uygun bir şişede (örneğin, 50 mL tüp, beher, Schott şişesi, vb.) gün için gereken ACSF miktarını alın ve karbojen ile oksijenlendirin (% 5 CO₂,% 95 O₂). Sadece morfoloji (örneğin, floresan paternleri) görüntüleniyorsa, beynin bütünlüğünü sağlamak ve hücrelerin ozmolarite etkilerinden olumsuz etkilenmemesini sağlamak için ACSF hala gereklidir, ancak ACSF'nin oksijenlenmesine gerek yoktur. Bu adımın yalnızca görüntüleme için tam beyin aktivitesi gerekli olduğunda gerçekleştirilmesi gerekir.
      NOT: Ortamın optimum oksijen doygunluğu için, karbojen tüpünün ucuna bir hava taşı ekleyin. Yeterince yüksek bir oksijen seviyesini garanti etmek için, aynı görüntüleme odasına gömülü larvaların sayısına ve yaşına bağlı olarak, görüntüleme odalarındaki ACSF'yi her 20-60 dakikada bir taze oksijenli ACSF ile değiştirmek gerekir (örneğin, tek bir gömülü larva için her saat ACSF değişimi yeterlidir. Paralel gömülü 14 dpf'den daha eski altı larva için, her 20 dakikada bir ACSF'nin değiştirilmesi gerekir), bu nedenle planlanan deneye göre gerekli miktarda oksijene doymuş ACSF planlayın.
2. Larvaların gömülmesi
   Tamamen
   1. anestezi uygulanmış larvaları plastik bir Pasteur pipeti ile (adım 1.4'te) hazırlanan montaj odasına aktarın. Ardından, düşük erime noktalı (LM) agarozun seyreltilmesini önlemek için fazla ortamı dikkatlice çıkarın. Aşağıdaki tüm adımlar, yeterli büyütme oranına sahip bir stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.
      NOT: Montaj haznesinin eğilmesi, ortamın tamamen çıkarılmasına yardımcı olabilir.
   2. Hayvanların kurumasını önlemek ve gereksiz stresi azaltmak için larvaların üzerine yeterince büyük bir LM-agaroz damlası ekleyerek (larvaların boyutuna bağlı olarak yaklaşık 1 mL) hemen bir sonraki adıma geçin.
   3. Agaroz katılaşmadan önce larvaları pozisyonda yönlendirin. Larvaların sırt kısmının yukarı doğru yönlendirildiğinden emin olun. Ayrıca, larvaları agarozun yüzeyine mümkün olduğunca yakın gömdüğünüzden emin olun.
      NOT: Aynı anda gömülmesi planlanan larvaların boyutuna ve sayısına bağlı olarak, agaroz konsantrasyonunu ayarlamak mümkündür. Örneğin, 30 dpf yaşında olan 1-3 larva için% 1.8 -% 2 LM-agaroz konsantrasyonu önerilir. 7 dpf yaşlı 1-4 larva için %2.5 LM-agaroz kullanılması en uygun olurken, 5-8 larva için %2 daha uygundur. Tamamen aktif bir beyin gerekiyorsa, larvaları çalıştırmak için gereken süreyi azaltmak için aynı anda sadece üç balığın yerleştirilmesi önerilir. Genel olarak, larvalar yaşlandıkça veya aynı anda daha fazla larvanın gömülmesi planlandıkça daha düşük konsantrasyonların (%1.8-%2) kullanılması önerilir.
   4. Görüntüler ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak kaydedilirse, larvaları içeren agaroz bloğunu küçük bir küboid şekle getirin. Bu, larvaların daha sonra görüntüleme odasına aktarılması için önemlidir. Dik bir mikroskop kullanılıyorsa, bu tür bir kırpma gerekli değildir, çünkü montaj odası aynı zamanda görüntüleme odası olarak da kullanılabilir. Şekil 1'de (üst kısım), bu adımların şematik bir açıklaması bulunabilir.
3. Beyni açığa çıkarmak
   NOT: Larvaları gereksiz yere yaralamamak için aşağıdaki tüm adımlar büyük bir dikkatle gerçekleştirilmelidir. Deney için tamamen aktif bir beyin gerekiyorsa, geçen her saniyede, balık hala agaroza tam olarak monte edilmiş ve oksijenli ACSF içermeyen açık bir kafatasına sahipken, beynin oksijen eksikliğinden muzdarip olacağını ve kuruyacağını unutmayın. Oksijen eksikliğinin etkileri, gömülü larvalar yaşlandıkça daha da dramatik hale gelecektir. Bu nedenle, ameliyatın sadece mümkün olan en kısa sürede değil, aynı zamanda iğne ile mekanik beyin hasarını önlemek için maksimum hassasiyetle yapılması önemlidir. Adım 3.2-3.4, eğitildiğinde balık başına 30 saniyeden fazla sürmemelidir.
4. Agaroz katılaşır katılmaz ameliyata başlayın. İlk olarak, kafaya serbest erişim ve net bir çalışma alanı elde etmek için ilgilenilen beyin bölgesinin üzerindeki tüm fazla agarozu kesin. Başın dorsal kısmı zaten agarozdan dışarı çıkıyorsa, bu adımı atlayın.
5. İlgilendiğiniz bölgeye bağlı olarak, ameliyata başlamak için bir yer seçin. Cam iğneyi alın ve dokuya çok derinlemesine nüfuz etmeden ciltten küçük bir kesi yapın. Bu, üst üste binen cildi soymak için başlangıç noktası olacaktır.
   NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, önemli yapılara zarar verme riskini azaltmak için asla doğrudan ilgilenilen bölgenin üzerinden başlamayın. Gerekirse, arka beynin arkasından başlamak ve istenmeyen cilt bölgesi soyulana kadar ileriye doğru çalışmak mümkündür.
6. Cildin bir kısmı boyunca çok küçük kesiklerle devam edin, iğneyi yüzeyin hemen altında zar zor hareket ettirerek çıkarmayı hedefleyin. Çoğu zaman beynin etrafında tamamen hareket etmek ve daire benzeri bir deri ve kafatası parçasını kesmek gerekli değildir, bunun yerine sadece kafa boyunca iki kesi yapmak ve ardından cildi bir veya diğer tarafa itmek gerekir. Şekil 2, beyinciklere serbest erişim sağlamak için en uygun kesme stratejisinin şematik bir temsilini göstermektedir.
   NOT: Bu mikrocerrahi hassas bir prosedürdür ve büyük olasılıkla, altta yatan beyne zarar vermeden cildi mükemmel bir şekilde çıkarmak için biraz eğitim gerektirecektir. Ayrıca, ilgilenilen beyin bölgesi için en uygun kesme stratejisini bulmanız ve deney süresince buna bağlı kalmanız önerilir.
7. Cildi tüm gömülü larvalardan çıkardıktan hemen sonra, istenmeyen cilt parçacıklarını ve kanı boşaltmak, beyni tamamen aktif tutmak ve kurumasını önlemek için agarozun üzerine (oksijenli) ACSF dökün.
   NOT: Deney için sağlıklı bir beyne ihtiyaç duyuluyorsa, bir seferde en fazla üç balık yemeniz önerilir.
8. Dik bir mikroskop kullanıyorsanız, doğrudan görüntüleme ile başlayın.
   1. Ters mikroskop kullanırken, küboid agaroz bloğunun altına küçük bir spatula kaydırın (adım 2.4).
   2. Görüntüleme odasının dibine küçük bir damla LM-agaroz ekleyin (örneğin, cam tabanlı tabak) ve larvaları içeren agaroz bloğunu hemen spatula ile 180° çevirin ve sıvı agaroz damlası yapıştırıcı görevi görürken nazikçe görüntüleme odasının dibine itin.
   3. Agaroz katılaştığında, görüntüleme odasını (oksijenli) ACSF ile doldurun ve ardından görüntülemeye başlayın. Şematik bir açıklama için Şekil 1'e (alt kısım) bakın.
9. Deney için tam beyin aktivitesi gerektiğinde, her zaman görüntüleme odasındaki ACSF'nin yeterince yüksek oksijen seviyesine sahip olduğundan emin olun. Bunu sağlamak için, ortam her 20-60 dakikada bir taze oksijenli ACSF ile dikkatli bir şekilde değiştirilmelidir (balığın sayısına ve boyutuna, görüntüleme odasının boyutuna ve yüzeyine ve görüntüleme süresine bağlı olarak).

Sonuçlar

Şekil 1: in vivo aşamalı görüntüleme için açık kafatası zebra balığının hazırlanması için şematik prosedür. Farklı adımlar için çalışma talimatları grafiğin kendisinde bulunabilir. Grafik, Florian Het...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Konfokal Lazer tarama mikroskobu	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Cam Kılcal tip 1	WPI	1B150F-4
Cam Kılcal tip 2	Harvard Aparatı	GC100F-10
Cam Lamel	deltalab	D102424
Görüntüleme odası	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Mikroskop Kamerası	Leica	DFC9000 GTC
İğne Çektirme tip 1	NARISHIGE	Model PC-10
İğne Çektirme tip 2	Sutter Aletleri	Model P-2000
Pastör-Pipetler 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35 mm petri kabı	Sarstedt	833900
90 mm petri kabı	Sarstedt	821473001