Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Fare Beyin Dokusunun Mekanik Özelliklerinin Karakterizasyonu

Özet

Kaynak: Canovic, E. P., et al. Atomik kuvvet mikroskobu, darbe girintisi ve reometri kullanarak beyin dokusunun çok ölçekli mekanik özelliklerinin karakterize edilmesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, küresel problu bir konsolun doku ile etkileşime girdiği ve uygulanan kuvvetler altında büküldüğü beyin dokusunun viskoelastik özelliklerini ölçmek için atomik kuvvet mikroskobunun (AFM) kullanımını göstermektedir. Bir dedektör üzerine saptırılan bir lazer ışını, girinti derinliğini ve kuvvet gevşemesini ölçmek için konsolu izler ve dokunun mekanik özelliklerinin karakterizasyonuna olanak tanır.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) özellikli Girinti

1. Midye türevi bir biyoyapıştırıcı ile 60 mm çapında Petri (P60) kaplarını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
   1. Optimum pH değeri 8.0 olan steril suda 0.1 M sodyum bikarbonattan oluşan bir nötr tampon çözeltisi stoğu hazırlayın. Sodyum bikarbonat tamponunu filtreyle sterilize edin (0,2 mikron) ve 4 °C'de saklayın.
   2. Laminer akış başlığında, sodyum bikarbonat tamponunda %6,25 midye türevi biyo-yapıştırıcı ve %3,125 sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisini karıştırın.
   3. 100μl biyo-yapışkan solüsyonu 60 mm çapında bir Petri (P60) kabına pipetleyin ve solüsyonu 3-5 cm çapında bir daireye yaymak için bir pipet ucu kullanın.
   4. P60 kaplarını laminer akış başlığında açıkta bırakın ve çözeltinin kurumasını bekleyin (~ 30 dakika). Bulaşıkları 1 kez fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve 2 kez steril suyla yıkayın. Bulaşıkları laminer akışlı bir başlıkta kurumaya bırakın ve kapalı bir plastik torbada 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. AFM'yi kalibre edin ve AFM'de bir beyin örneği oluşturun. NOT: Üreticiye göre AFM kalibrasyon talimatlarını izleyin.
   1. Nominal yay sabiti 0,03 N/m ve 20 μm çapında borosilikat boncuk olan bir AFM probunu prob tutucusuna dikkatlice yükleyin.
   2. Termal ayar yöntemini kullanarak AFM konsolunun yay sabitini ve ters optik kol hassasiyetini (InvOLS) kalibre edin.
      NOT: Bir AFM probu için yay sabiti hesaplandıktan sonra, tekrarlanan kullanımla sabit kalmalıdır. Bununla birlikte, lazer konsol ile her yeniden hizalandığında konsol InvOLS'nin yeniden kalibre edilmesi gerekecektir. Ek olarak, polistiren gibi konsoldan birkaç kat daha sert bir alt tabakaya karşı kalibrasyon yapılmalıdır.
   3. Sahneye monte ısıtıcıyı açın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
   4. Beyin dilimini P60 tabaklarının üzerine monte edin.
      1. 350 μm kalınlığında bir beyin dilimini ve karbondioksitten (CO₂) bağımsız ortamı yuvarlak tabanlı şişeden midye türevi biyoyapıştırıcı ile kaplanmış bir P60 kabına yavaşça dökün.
      2. Beyin dilimini hafifçe eğerek P60 tabağının ortasına yerleştirin. Gerekirse, kendi üzerine katlanmış bir beyin dilimini açmak için ortamı manuel bir pipetten yavaşça pipetleyin veya daha iyisi, beyin dilimini tabağın ortasına yerleştirin.
      3. Fazla ortamı bir P1000 pipeti kullanarak dikkatlice çıkarın (elektrikli süpürgeyi kullanmayın).
      4. P60 kabının üzerine bir kapak yerleştirin ve beyin diliminin 20 dakika yapışmasına izin verin.
   5. AFM kafasını çıkarın, P60 kabına monte edilmiş beyin dilimini AFM tablasına yerleştirin ve ~2 ml önceden ısıtılmış CO₂ bağımsız ortam ekleyin.
   6. Beyin dilimini çevreleyen ortama indirildiğinde yüzey gerilimi nedeniyle kırılmasını önlemek için AFM probunun üzerine dikkatlice bir damla ortam ekleyin.
   7. AFM kafasını sahneye yeniden yerleştirin ve kafayı ortama daldırılana kadar indirmeye başlayın.
   8. Üstten görünümlü şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamerasını kullanarak lazeri konsol üzerine yeniden konumlandırın.
      NOT: Lazerin konsol üzerindeki hizalaması, hava ve ortamın kırılma indisindeki farka bağlı olarak biraz değişmiş olacaktır.
   9. Konsolun ılık bir sıvıya daldırılmaya alışması için 5 dakika bekleyin, ardından ayna hizalamasını 0 V'luk serbest sapmaya sıfırlayın.
   10. Üreticinin talimatlarına göre AFM probu üzerinde bir termal spektrum çalıştırın. AFM probunun ortamdaki InvOLS'sini yeniden hesaplamak için ilk termal tepe noktasının uyumunu kullanın.
   11. Optik mikroskobu kullanarak, numune aşamasını beynin ilgilendiği bölge AFM probunun altında olacak şekilde hareket ettirin. NOT: Korpus kallozum, çevresindeki gri maddeden daha opak olduğu için koyu görünecektir. Korteks, korpus kallozumdan üstündür.
   12. Ayna hizalamasını 0 V'luk serbest sapmaya sıfırlayın.
   13. AFM yazılımındaki Toplam ve Sapma Ölçer'de, AFM kafasını devreye sokmak için "Etkinleştir"e tıklayın.
   14. AFM kafasındaki konum kadranını kullanarak, konsol ile numune arasında temas olana kadar kafayı indirin.
3. Sürünme uyumluluk deneyleri yapın.
   1. Yazılımın işlev düzenleyicisinde uygulanan bir kuvvet işlevi oluşturun. Kuvvet fonksiyonu, 5 nN'lik bir ayar noktasına 0,1 sn'lik bir rampa ve bunu 20 saniye tutmak, ardından 0 nN'lik bir uygulanan kuvvete kadar 1 sn'lik bir rampadan oluşur.
      1. Girinti Ana Paneli'nde, girinti yöntemi altında, Girinti Modu için "Yükle"yi, birimler için "N"yi ve Girinti İşlevi için "İşlev düzenleyici"yi seçin.
      2. İşlev düzenleyicide, Segment Parms Panelinde, 0,1 sn'lik bir süre ile 0 nN'de başlayan ve 5 nN'de biten bir uygulanan kuvvet işlevi segmenti oluşturun. "Ekle -->" i tıklayın.
      3. Bir sonraki segment için başlangıcı 5 nN'ye, bitişi 5 nN'ye ve zamanı 20 saniyeye ayarlayın. "Insert -->" i tıklayın.
      4. Son segment için başlangıcı 5 nN'ye, bitişi 0 nN'ye ve süreyi 1 saniyeye ayarlayın. Ardından, "Çiz" e tıklayın ve İşlev Düzenleyici penceresini kapatın.
   2. Ana Panelin Kuvvet Sekmesinde, "tetiklemeden sonra girinti rampası"nı işaretleyin ve uygulanan kuvvet fonksiyonunu 0,1 V'luk bir tetikleme noktasına ulaştıktan sonra tetiklenecek şekilde ayarlayın.
   3. Ana Panelin Kuvvet Sekmesinin altındaki "Tek Kuvvet"e tıklayın, bu da sürünme uyumluluğu için yapılandırılmış-uygulanan kuvvet fonksiyonunu tetikleyecektir.
   4. Tek kuvvet girintisi bittikten sonra, AFM kafasını numune ile teması olmayacak şekilde kaldırın. Ardından, kafayı yeniden takın ve serbest sapmayı yeniden sıfırlayın.
   5. Yeni bir ilgi alanı bulmak için numune aşamasını yeniden konumlandırın ve temas kurmak için AFM kafasını indirin. NOT: Numune tablası hareket ettirildiğinde AFM kafası numune yüzeyinden geri çekilmelidir.tage. Bunun yapılmaması, hassas AFM konsolunun hasar görmesine neden olabilir.
   6. İstenen miktarda veri toplanana kadar adımları tekrarlayın.
4. Kuvvet gevşeme deneyleri yapın.
   1. Yazılımın işlev düzenleyicisinde uygulanan bir girinti işlevi oluşturun. Girinti işlevi, 3 μm'lik bir ayar noktasına 0,1 sn'lik bir rampa ve bunu 20 saniye boyunca tutmak, ardından 0 μm'lik bir girinti derinliğine kadar 1 sn'lik bir rampadan oluşur.
      1. Girinti Ana Panelinde, girinti yöntemi altında, Girinti Modu için "Girinti"yi seçin, Birimler için "m" ve Girinti Fonksiyonu için "Fonksiyon düzenleyici".
      2. Fonksiyon düzenleyicide, Segment Parms Panelinde, 0,1 sn'lik bir süre ile 0 μm'de başlayan ve 3 μm'de biten bir uygulanan kuvvet fonksiyonu segmenti oluşturun. "Insert -->" düğmesine tıklayın.
      3. Bir sonraki segment için başlangıcı 3 μm'ye, bitişi 3 μm'ye ve süreyi 20 saniyeye ayarlayın. "Ekle -->" i tıklayın.
      4. Son segment için başlangıcı 3 μm'ye, bitişi 0 μm'ye ve süreyi 1 sn'ye ayarlayın. Ardından "Çiz" e tıklayın ve İşlev Düzenleyici penceresini kapatın.
   2. Ana Panelin Kuvvet Sekmesinde, "tetiklemeden sonra girinti rampası"nı işaretleyin ve uygulanan kuvvet fonksiyonunu 0,1 V'luk bir tetikleme noktasına ulaştıktan sonra tetiklenecek şekilde ayarlayın.
   3. Kuvvet gevşetme için yapılandırılmış olarak uygulanan girinti fonksiyonunu tetiklemek için Ana Panelin Kuvvet Sekmesinin altındaki "Tek Kuvvet"e tıklayın.
   4. Tek kuvvetle girinti bittikten sonra, AFM kafasını numune ile temas etmeyecek şekilde kaldırın, ardından kafayı yeniden takın ve sapmayı yeniden sıfırlayın.
   5. Yeni bir ilgi alanı bulmak için sahneyi yeniden konumlandırın ve temas kurmak için başınızı indirin.
   6. İstenen miktarda veri toplanana kadar her iki ölçümü de tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hibernate-A medium	Gibco	A1247501	Yetişkin dokusu içinCO 2'den bağımsız nöral ortam
Atomik kuvvet mikroskobu, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri dish heater	Asylum Research	-
AFM probu, 0.03 N/m, 10 um yarıçaplı borosilikat küre	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	Midye türevi biyoyapıştırıcı
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	Alternatif tedarikçiler kullanılabilir
Sodyum hidroksit, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	Alternatif tedarikçiler kullanılabilir

GS