Fare Beyin Dokusundaki Metalleri Görselleştirmek için Lazer Ablasyon-Endüktif Eşleştirilmiş Plazma-Kütle Spektrometresi

Özet

Kaynak: Hare, D. J., et.al. Lazer Ablasyon ile Beyin Dokusundaki Metallerin Görüntülenmesi - Endüktif Eşleşmiş Plazma - Kütle Spektrometresi (LA-ICP-MS). J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, fare beyin dokusundaki metal dağılımlarını görselleştirmek ve ölçmek için lazer ablasyon-indüktif olarak eşleştirilmiş plazma-kütle spektrometresinin (LA-ICP-MS) kullanımını göstermektedir. Protokol, numune parçacıklarının bir aerosolünü oluşturmak için lazer ablasyonunu, parçacıkların yüksek sıcaklıktaki plazmada iyonlaştırılmasını ve iyonları kütle-yük oranlarına göre ayırmak için kütle spektrometresini içerir. Daha sonra metallerin doku içindeki uzamsal dağılımını ortaya çıkaran kantitatif görüntüler oluşturmak için özel bir yazılım kullanılır.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Analiz için LA-ICP-MS'nin hazırlanması

1. Standartları ve numuneyi, LA ünitesine takılan CCD kameranın alan derinliği içinde olduklarından emin olarak ablasyon odasına yerleştirin. Cihazın ayarlanması gerekiyorsa, uygun bir referans materyali ekleyin (örneğin, NIST 612 Camdaki Eser Elementler). Ablasyon haznesini kapatmak için hazne kapısındaki iki vidayı parmakla sıkın.
2. ICP-MS yazılımında, 'Bakım' veya benzeri panelde argon gazı vanasını açın ve uygun diyalog kutusunda taşıyıcı gaz akışını 1.2 L ^min-1'e ayarlayın.
   NOT: Bu protokolde taşıyıcı gaz olarak argon kullanılır. Birkaç örnek, taşıyıcı gaz olarak helyum veya helyum ve argon karışımı kullanır.
3. LA yazılımında, hücreyi en az 30 dakika boyunca argon gazıyla yıkamak için 'temizleme' düğmesine tıklayın.
   NOT: Temizleme süresi, bir 'temizleme süresi' veya benzeri bir düğmeye tıklanarak değiştirilebilir. İki hacimli ablasyon hücresine sahip bir ablasyon sistemi kullanırken, sahneyi periyodik olarak her bir köşeye hareket ettirin ve hücreden mümkün olduğunca fazla artık havanın çıkarılmasını sağlamak için hücreyi çapraz olarak hareket ettirin. Bu, 'ev aşamaları' veya eşdeğer işlev seçilerek elde edilebilir.
4. 'Plazma açık' düğmesine tıklayarak ICP-MS'yi açın ve iki saat ısınmasına izin verin, bu sırada 1.5 - 2.4 adımları gerçekleştirilebilir. Cihaz ayarları üreticiler arasında farklılık gösterir.
5. Doku standartlarının temsili ablasyonu
   1. Çizgi aracını seçin ve doku yüzeyi boyunca yaklaşık 3 mm uzunluğunda tek bir ablasyon çizgisi çizin.
   2. Deney listesindeki ablasyon çizgisine sağ tıklayarak ve aşağıdakileri değiştirerek parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: ışın çapı (kullanıcı tarafından uygun şekilde seçilir; burada 30 μm kare ışın kullanılır), tarama hızı (saniyede ışın çapının 4 katı; 120 μm ^s-1) ve enerji akışı (yumuşak doku için 0,3 -0,5 J ^cm-2; daha sert matrisler için gerekirse optimize edin). 30 μm doku kalınlığında, lazer ışını bu dokunun tam kalınlığına nüfuz etmez ve mikroskop desteğinden herhangi bir potansiyel kirletici maddeyi ortadan kaldırır. Karbona normalleştirme, ablasyon yapılan doku miktarındaki değişimi düzeltmek için kullanılabilir. 'Varsayılan' radyo düğmesini seçerek bu parametreleri sonraki her satır için varsayılan olarak ayarlayın.
   3. İlk satırı seçerek, sağ tıklayıp 'taramaları çoğalt'ı seçerek bu satırı altı kez çoğaltın. Çizgilerin x veya y ekseninde kiriş çapına göre kaydırıldığından emin olun. Bu, standart başına kiriş çapına göre aralıklı olarak toplam yedi satır verir.
   4. Her standart için 1.5.1 - 1.5.3 adımlarını tekrarlayın ve çizginin aynı uzunlukta olduğundan emin olun.
6. Ablasyon alanını numunenin üzerine çizmek için aşağıdaki iki yöntemden birini izleyin:
   NOT: Numune hatları için aynı tarama parametrelerinin (ışın çapı, tarama hızı, enerji akışı) kullanıldığından emin olun.
   1. LA sistemi geniş bir görüş alanıyla donatılmışsa, çizgi aracını seçin ve numunenin sol üst köşesinden, numuneyi en geniş noktasından kaplayacak kadar uzun bir çizgi çizin 1.5'te belirtilen aynı lazer parametrelerini kullanarak. Bu taramayı 1.5.3'te belirtildiği gibi, numunenin tam olarak kapsanmasını sağlamak için ışın çapına göre gerektiği kadar aralıklı çizgilerle çoğaltın.
   2. Geniş alan görünümü mevcut değilse, tüm örneği kaplayan bir dikdörtgenin köşelerine karşılık gelen x ve y koordinatlarını (tipik olarak ana ekranda 'sahne konumu' veya benzeri olarak gösterilir) belirleyin ve kaydedin. Tüm numune alanını kaplayan paralel ablasyon çizgilerini konumlandırmak için bu koordinatları kullanın.
   3. Numuneyi taradıktan en geç ~20 saat sonra, 1.5'te açıklanan işlemi tekrarlayarak standartların aralıklı taraması için çizgiler çizin. Numunenin tarama süresine bağlı olarak, bu birden çok kez gerekli olabilir. Deneyi, standartların ek bir taraması ile sonlandırın.
      NOT: Hücre temizlenirken x ve y koordinatlarını belirlerken, ana konumların seçilmesi ve eksenin ilgili kalibrasyonu, x ve y koordinatları için daha önce elde edilen özellikleri değiştirirken, fark (yani çizginin uzunluğu) etkilenmeyecektir.

2. ICP-MS için Veri Toplama Yöntemlerinin Kurulması

1. Standart ablasyon hattı için, tek bir hat için toplam analiz süresini belirlemek için hattın uzunluğunu lazer tarama hızına bölün. Örnek satır için bunu tekrarlayın.
2. ICP-MS yazılımında yeni bir yöntem oluşturun (burada 'toplu' olarak gösterilmiştir) ve 'zaman çözümlü analiz' veya eşdeğerinin seçildiğinden emin olun. Algılanacak m/z değerlerini seçin ve ardından her m/z için entegrasyon süresini, bir döngü için toplam entegrasyon süresi 0,25 s'ye eşit olacak şekilde ayarlayın. 'Toplu İşi Farklı Kaydet'e tıklayın ve buna göre adlandırın (örneğin, Std1).
   NOT: Numune, lazer ışınını ışın çapının dört katı hızla geçeceğinden, bu, her kütle için ışın çapına eşdeğer bir veri noktasının kaydedilmesini sağlar. Örneğin, 100 μm'lik bir spot boyutu kullanarak, 0,25 s'lik bir entegrasyon süresine sahip 400 μm ^s-1'lik bir tarama hızı, gerçek piksel boyutlarına sahip görüntüler üretecektir. Entegrasyon süresi, hassasiyeti artırmak için ayarlanabilir; Entegrasyon süresi 0,33 sn'ye çıkarılırken, tarama hızı ışın çapının üç katına kadar yavaşlatılmalıdır.
3. Standartlar için, uygun kutuya her satır taraması için analiz süresini ve ayrıca lazer ısınma ve yıkama sürelerini hesaba katmak için ek 15 saniye girin. Aynı sayıda alımla (genellikle sırayla numaralandırılmış) bir örnek çalıştırma listesi (yani taramaların çalıştırılma sırası) girin; yani 001, 002, vb.), standart satırların toplam sayısı olarak.
4. Numune için, mevcut yöntemi veya partiyi alternatif bir dosya adıyla kaydederek standartlar için kullanılan yöntemi çoğaltın ve toplam alım süresini (ek 15 s dahil) ve toplam alım sayısını, numuneyi boşaltacak satır sayısıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
   NOT: Çoğu LA-ICP-MS sistemi tek yönlü bir tetikleyici kullandığından (LA, ICP-MS'yi tetikler), ICP-MS yazılımının, sonraki ablasyon hattı başlamadan önce LA'dan gelen tetikleyiciyi beklemesi önemlidir. ICP-MS edinme penceresinde 'başlangıç bekleniyor' yazacaktır.

3. Deneyin Çalıştırılması

1. İlk yöntemi veya partiyi kuyruğa ekleyerek ICP-MS kuyruğunu başlatın ve yazılımın LA sisteminden tetikleyiciyi beklediğinden emin olun.
2. LA yazılımında, 'emisyon'a tıklayarak lazer güç kaynağını etkinleştirin, 'çalıştır'a tıklayın ve uygun kutularda lazer ısınma süresini 10 saniyeye ve yıkama süresini 20 saniyeye ayarlayın.
   NOT: Bu taşma, lazer sonraki her ablasyon hattına başladığında ICP-MS'nin yeni veriler almaya hazır olmasını sağlayacaktır.
3. 'Başlat'a tıklayarak lazer dizisini başlatın. İki hacimli bir hücre kullanıyorsanız, numune kabının yerinde olduğundan emin olun.

4. Kantitasyon Standartlarının Hesaplanması

NOT: ICP-MS verilerini görüntülere dönüştürmek için birden fazla varyasyon vardır. Bunlar, açık kaynaklı dillerde yazılmış ev yapımı yazılım araçlarının, ticari makroların ve veri analiz yazılımlarının kullanımını içerir. Burada, özel bir LA-ICP-MS veri analiz paketine dayalı olarak yakın zamanda geliştirilen yazılım eklentisini kullanın.

1. Çalıştırma verilerini içeren tüm toplu iş klasörlerini (001.d, 002.d, vb.) analiz yazılımının yüklü olduğu ayrı bir bilgisayara aktarın. Toplu işlemin her satırı için *.csv veri dosyalarını ayrı bir klasöre ayıklayın.
   NOT: *.csv dosyalarını otomatik olarak yeni bir klasöre aktarmak için bir komut dosyası kullanılması önemle tavsiye edilir. Daha fazla ayrıntı için ekteki Python koduna bakın. Bu komut dosyası, Agilent 7700 veya 8800 Serisi ICP-MS'ye uyacak şekilde yazılmıştır, ancak diğer üreticilerin çıktı dosyasına uyacak şekilde düzenlenebilir.
2. Yazılım platformunu açın ve aşağıda açıklandığı gibi nicel görüntüler üretmek üzere standartları içe aktarmak ve analiz etmek için sekmeleri sırayla izleyin.
3. Verileri ilk standart partiden içe aktarmak için, 'Dosya Türü' için 'Agilent .csv', 'İçe aktarma türü' için 'Tüm klasör'ü seçin ve 'Tarih biçimi'nin bilgisayar biçimiyle aynı olup olmadığını kontrol edin. 'İçe Aktar'ı tıklayın, ilk standart kümesi için .csv dosyalarını içeren klasörü seçin ve 'Taban Çizgileri' sekmesine gidin.
4. Baseline subtraction
   1. Araç çubuğundaki ana uygulama açılır menüsünden 'Otomatik Seçimler' sekmesini (komut 2) kullanın, 'İçe aktarılan bilgiler'i seçin ve 'Devam Et'i tıklayın.
   2. 'Tümünü Seç'e tıklayın ve entegrasyon için 'Baseline_1'yi seçin.
   3. Her bir tarama çizgisinin ilk 10 saniyesini seçmek için (lazer ısınma süresine karşılık gelir), '0' ve '(satır süresi - 10 sn)' ikinci değerlerini girerek verileri kırpın ve 'Entegrasyon ekle'ye tıklayın (örneğin, 35 s'lik bir tarama satırı için '0' ve '25' değerlerini girin).
5. Örnek verileri seçmek için 4.4'te açıklandığı gibi 'Otomatik Seçimler' sekmesini kullanın, ancak entegrasyon olarak 'Output_1'yi seçin. Arka plan sinyalini hariç tutmak için verileri her standart hattın başından ve sonundan kırpın (örn. 35 sn tarama hattı için '13' ve '4' değerlerini girin).
6. Standartlardaki olası deliklerin neden olduğu sinyal düşüşlerini hariç tutmak için, 'Örnekler' sekmesinde, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip bir kanal seçmek için grafik alanının sol üst köşesindeki 'Kanallar'ı tıklayın (örneğin, C13 veya P31). Sinyaldeki keskin düşüşleri not edin ve numuneler içindeki normal varyasyonun altında yeterince düşük, ancak sinyaldeki keskin düşüşleri seçmek için yeterince yüksek bir CPS değeri seçin.
7. 'DRS' sekmesine tıklayın ve 'Mevcut Veri Azaltma Şeması' için 'Baseline_Subtract'yi seçin. "Dizin Kanalı" için 4.6 arasından kanalı ve "Düşük sinyalleri maskelerken kullanılacak eşik" için CPS değerini seçin. Lazerden ICP-MS'ye sinyal aktarımındaki gecikmeyi hesaba katmak için 'Düşük sinyallerden önce/sonra kırpılacak saniye sayısı' için <0.5 s'lik bir değer girin.
8. Düşük sinyal alanlarının yeterli şekilde maskelendiğini onaylamak için 'Örnekler' sekmesine geri dönün ve işlenmiş (örn. Fe56_CPS) bir kanal izi seçin. Gerekirse CPS ve 'Düşük sinyallerden önce/sonra kırpmak için saniye' değerlerini 4.7'deki gibi tekrarlayın ve iyileştirin.
9. 'Sonuçlar' sekmesini tıklayın ve ana uygulama açılır menüsünden 'Verileri dışa aktar'ı seçin. Sonuçların bir elektronik tablo veri dosyasını oluşturmak için bir dosya adı girin (örneğin, Std1 hesaplamaları, Std2...).
10. Veri dosyasını uygun bir elektronik tablo programında açın ve nicelleştirilecek her bir kanal için CPS değerlerini hesaplayın. Ölçülebilir her element için CPS değerlerinden ppm'ye (μg g⁻¹) dönüştürme faktörünü hesaplamak için çözelti nebulizasyonu ICP-MS'den önceden belirlenmiş metal konsantrasyonlarını kullanın.
11. Çalıştırmadaki tüm standart kümeleri için 4.3 - 4.10 arasındaki adımları tekrarlayın.

5. Kantitatif Görüntülerin Oluşturulması

1. Yazılımı açmak için komut istemine 'Biolite()' yazın.
2. 'Görüntüleri Yükle'ye tıklayarak ve örnek görüntü için .csv dosyalarını içeren klasörü seçerek örnek verileri içe aktarın.
3. Arka plan düzeltmesi
   Örnek
   1. için arka plan düzeltmesi uygulamak için 'Taban Çizgileri' sekmesine tıklayın. Ekranda istenen fosfor (P31) görüntüsünde, dikdörtgen çizim aracını kullanarak arka plan alanlarını seçin. Mümkün olduğu kadar çok bölge seçmek, bu kafa karıştırıcı faktörlerden yeterli telafiyi sağlamak için görüntü çapında bir sinyal/plazma kayması haritası oluşturur.
   2. Arka plan sinyalini daha görünür hale getirmek için grafik düzenleme aracını seçin (görüntülenen görüntünün sol üst köşesi) ve görüntüye sağ tıklayın. 'Görüntü Görünümünü Değiştir'i seçin ve 'Z='deki İlk Renk'i büyük bir negatif değere (ör. -100.000) değiştirin. 'Bitti'yi tıklayarak devam edin.
4. CPS/ppm düzeltme faktörleri için bir tablo getirmek için 'Standartlar' sekmesine tıklayın. Öğelerin her biri için adım 4.10'daki standartlardan hesaplanan değerleri girin. Bu adım, ICP-MS'deki hassasiyet kaymasının düzeltilmesine yardımcı olacaktır. 'Git!'
5. Her öğe ve her adım için görüntüleri tutan 'Veri' sekmesinden 'Veri Tarayıcısı'nı açın.
6. Bir görüntüyü dışa aktarılmak üzere sonlandırmak için, 'StdCorrImages' klasöründe istediğiniz görüntüyü seçin, görüntü adına (*_ppm) sağ tıklayın ve 'NewImage'a tıklayın. İstediğiniz renk tablosunu ve renk ölçeğini seçmek için 'Görüntü Görünümünü Değiştir'i açmak için görüntüye sağ tıklayın. Görüntüye sağ tıklayıp 'Ek Açıklama Ekle'yi seçerek görüntüye bir renk ölçeği ekleyin. Sol üstteki açılır menüden 'ColorScale'i seçin ve istediğiniz renk ölçeğini değiştirmek için sekmeleri kullanın.
7. Bir görüntüyü dışa aktarmak için, söz konusu görüntünün seçili olduğundan emin olun ve 'Dosya' sekmesine gidin ve 'Grafikleri kaydet...'i tıklayın. İstediğiniz formatı seçin ve görüntüyü kaydedin. Alternatif olarak, seçilen görüntü kopyala ve yapıştır araçları kullanılarak aktarılabilir.
8. İlgilendiğiniz tüm görüntüler için 5.6 ve 5.7 adımlarını tekrarlayın.
9. Ayrık bölgelerin niceliklendirilmesi
   1. ROI araçlarını etkinleştirmek için 'Analiz' sekmesine, 'Paketler'e gidin ve 'Görüntü İşleme'yi seçin.
   2. İstediğiniz görseli seçin ve 'Görsel' sekmesine gidin ve 'ROI...' seçeneğine tıklayın. 'ROI çekilişini başlat'a tıklayın ve örnekte ilgilendiğiniz bir bölgeyi seçmek için bir çizim aracı kullanın. Çizimi bitirmek için 'Yatırım Getirisini Bitir'i tıklayın.
   3. Seçilen yatırım getirisine ilişkin istatistikleri almak için 'Resim' sekmesine gidin ve 'İstatistikler...'i tıklayın.
   4. Sonuçları kopyalayıp ayrı bir e-tabloya yapıştırın. Tüm bölgeler ve ilgili unsurlar için ROI seçimini (5.9.2) tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Soda cam mikroskop slaytları	n/a	n/a	Tipik slaytlar tüm deneyler için uygundur
NWR213 Lazer Ablasyon sistemi	ESI Ltd	n/a	Bu deneylerde kullanılmıştır. Uygun olan diğer üreticiler, protokolde değişiklik yapılması gerekebilir
Agilent 8800 Serisi ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Bu deneylerde kullanılır. Uygun olan diğer üreticiler,
Iolite	Iolite Software	n/a	http://iolite-software.com/ protokolünde değişiklik yapılması gerekebilir. Başka yöntemler de mevcuttur, bkz. protokol
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm