Tübülin Kusurlarını İncelemek için Bir Sıçan Modelinde İkinci Harmonik Nesil Görüntüleme

Özet

Kaynak: Piazza, V., et al., Santral Miyelinde Tübüline Bağlı Defektlerin İncelenmesi için Etiketsiz Doğrusal Olmayan Optikler. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, iki fotonlu uyarma mikroskobu kullanılarak bir sıçan beyin dokusu dilimindeki mikrotübül anormalliklerini görüntüleme prosedürünü göstermektedir. Tübülin kusurlarını ve azaltılmış miyelin üretimini tespit etmek için ikinci harmonik üretim (SHG) sinyallerini kullanır.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Mikroskoba aktarın

1. Mikroskop farklı bir odadaysa, sıcaklığı korurken doku bölümlerini aktarmak için ısıtılmış jel paketleri içeren yalıtımlı bir kutu hazırlayın. Kutu ayrıca görüntüleri görüntülenene kadar sıcak tutacaktır.
2. Numuneyi mikroskobun altına koyun ve iletilen ışıkla oküler aracılığıyla doğrudan gözlem yaparak objektifin altına düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
   NOT: Amaç, yayılan (ve dolayısıyla algılanan) ikinci harmonik üretim (SHG) sinyalini en üst düzeye çıkarmak için tahmin edilen yayma yapılarını lazerin salınım yönüyle hizalamaktır.
3. İnce bir sıvı film tüm numuneyi kaplayacak şekilde fazla HBSS'yi çıkarın. Numunenin aşırı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için sıvı filmi birkaç dakikada bir görsel olarak kontrol edin.
   NOT: Açıklanan koşullar altında, bir bölüm en fazla 20 dakika kullanılır. Numunenin kurutulması şiddetli artefaktal etkilere neden olur (Şekil 1A). Daha uzun görüntüleme sürelerine ihtiyaç duyulursa, daha fazla HBSS eklemek yerine bölümün ılık, taze bir ortamda periyodik olarak ıslatılması önerilir. Dokuyu hareketsiz hale getirmek için perfüzyon odalarının ve yapıştırıcının veya düşük erime noktalı agarozun kullanılması, daha uzun deneyler yapılması gerektiğinde de önerilir.
4. Mikroskop aşamasını, karanlık inkübasyon odasının tüm kapılarının kapatılmasını veya inkübasyon odasının siyah naylon poliüretan kaplı bir kumaşla kaplanmasını içerebilecek, taranmamış görüntüleme için hazırlayın.

2. Görüntüleme

1. İletim yolu boyunca "taranmamış" görüntüleme modunu seçin. Bu şekilde, tübülinin zayıf SH sinyalinin yakalanması optimize edilecektir.
2. LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA hedefini seçin.
3. 12,6 μs'lik bir piksel bekleme süresi ile 13 mW ile 26 mW arasında bir lazer gücü ayarlayın. 512 piksel x 512 pikselden büyük olmayan, 5 hızında ve ortalama 2 olan, ortalama 15 s'lik bir çekim süresi için resimler çekin.
   NOT: Daha yüksek lazer güçleri ve/veya daha uzun bekleme süreleri kullanmak örneğe zarar verebilir (Şekil 1B).
4. Önce 485 nm kısa geçiren filtre (SP485) kullanarak görüntü çekin ve ikinci adımda keskin bir 405 nm bant geçiren filtre (BP405; Şekil 2).
   NOT: Sahte parlak alan görüntüleri, görünür bir çizginin artık lazer ışığı kullanılarak aynı dedektörden alınabilir (405 nm veya 488 nm lazerler en iyi sonucu verir).

Sonuçlar

Şekil 1: Eser örnekleri. (A) Numunenin kuruması nedeniyle artefakt. (B) Aşırı maruz kalma nedeniyle artefakt. Ölçek çubukları: 30 μm.

Malzemeler