Fare Retinal Eksplantlarında Nöronal Dendritik Dinamiklerin Hızlandırılmış Konfokal Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno-İlişkili Virüs Etiketlemesini Kullanarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, canlı fare retinal eksplantlarında dendritik dinamikleri görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanımını göstermektedir. Retinayı konfokal bir mikroskop altında stabilize etmek, yıldız patlaması amakrin internöronlarını görselleştirmek için epifloresan görüntüleme yapmak ve amakrin dendritik morfolojideki değişiklikleri izlemek için hızlandırılmış 3D görüntüler yakalamak için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Canlı tam montajlı retina preparatlarının hızlandırılmış konfokal görüntülemesi

1. Şekil 1.NOT: Ters konfokal sistemler için, düz montajlar retinal ganglion hücreleri (RGC) tarafı aşağı bakacak şekilde doğrudan inkübasyon odasının cam alt lamel üzerine yerleştirilir. Retinalar lamel ile temas ettiğinde hareket ettirilemezler.
2. Hazneyi oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile doldurun ve pompayı ve sıcaklık kontrol cihazını açın (sıcaklık 32-34 °C, akış hızı 1 mL/dak). Sıcaklığın 34 °C'nin üzerine çıkmasına izin vermeyin.
3. Retinal düz montajı perfüzyon odasına aktarmak için pompayı durdurun ve odadaki aCSF'yi çıkarın. Karışık selüloz ester (MCE) diskini retinal düz montajlı (boş) inkübasyon odasına yerleştirin.
4. Düz montajın üzerine bir numune ağırlığı yerleştirin; yüzey gerilimini kırmak için ağırlığı önceden ıslatın. Hazneyi ısıtılmış aCSF ile tekrar doldurun ve aCSF'yi ~1 mL/dk'da dolaştırın.
5. 25x su daldırma objektifi (sayısal açıklık 0.95) ile burunluğu görüntüleme odasına yerleştirin. Epifloresan ışık kullanarak ilgilenilen etiketli hücreleri tarayın (Şekil 1C).
6. İlgilenilen dendritik özellikleri yakalamak için görüntüleme sesini ayarlayın.
   NOT: Bu çalışma, kare başına 1024 x 1024 piksel, z-adım 1 μm ve her z-yığını arasında 2 dakikalık bir kare hızında tam dendritik çardağı yakaladı. Son görüntü boyutları ~100 μm x 100 μm x 20 μm'dir.
7. Lazer gücünü en uygun ayara ayarlamak için, hem aşırı doygun hem de az doygun pikselleri tanımlayan bir arama tablosu kullanın. Tarama sırasında, lazer gücünü hiçbir piksel aşırı doygun olmayacak şekilde ayarlayın (yani, 255 veya üzeri bir yoğunlukta). Gerektiği kadar veya floresan sinyalinde önemli ve tespit edilebilir bir azalma ve gürültüde bir artış olana kadar (tipik olarak 2-4 saat) görüntülemeye devam edin.
   NOT: Pikseller tam dinamik aralığa dağıtıldığında evrişim algoritmaları en iyi şekilde çalıştığından, azaltılmış lazer gücü önerilir. Piksel yoğunluğu 254'ü geçmemelidir; Nöritlerin ampirik analizleri, 170'in altındaki piksel değerlerinin evrişim için ideal olduğunu ortaya koydu. Satır ortalaması (2-3) ile yüksek tarama hızları (400-600 Hz), aynı toplam piksel bekleme süresinin tek, daha yavaş taramalarına tercih edilir. Uzun süreli görüntüleme alanı genellikle foto ağartıcılar, ancak diğer eksplant bölümleri canlı kalır. Düz bir montajdaki birden fazla bölge, her biri 2-4 saat boyunca ve toplam 6 saatlik bir inkübasyon süresi ile görüntülenebilir. 6 saatten fazla görüntüleme seansları sistematik olarak test edilmemiştir. Nörit bozunması ve kabarcıklanması, eksplant canlılığının azaldığının işaretleridir.

Sonuçlar

Şekil 1: Canlı hücre görüntüleme inkübasyon odası kurulumu. (A) Isıtma, çözelti ve görüntüleme bileşenlerini gösteren canlı görüntüleme inkübasyon aparatı. Çift ısıtıcı, ısıtmalı bir inkübasyon odası platformu (mavi konektör elektrotlu arka d...

Malzemeler