$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İnsan Koku Alma Kılıfı Glia (ihOEG, Ts12 ve Ts14) kültürü
NOT: Bu işlem steril koşullar altında, doku kültürü biyogüvenlik kabininde yapılır.
- 50 mL ME10 OEG kültür ortamı hazırlayın.
- 15 mL'lik konik bir tüpte 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'u veya DMEM / F12-Fetal Sığır Serumu (FBS) hazırlayın.
- Her iki ortamı da 37 °C'de temiz su banyosunda 15 dakika ısıtın.
- Ts12 ve Ts14 hücre şişelerini temiz su banyosunda 37 °C'de çözdürün.
- Hücreleri yeniden askıya alın ve adım 2'de hazırlanan DMEM / F12-FBS kültür ortamına ekleyin.
- 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı arzulayın.
- 500 μL ME10 ortamı ekleyin ve peleti yeniden süspanse edin.
- 3 mL ME10 içeren bir p60 hücre kültürü kabı hazırlayın ve hücresel süspansiyonu damla damla ekleyin.
- Hücreleri plaka boyunca eşit şekilde dağıtmak için hareket ettirin.
- % 5 CO 2.
NOT: Birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri kokültür için optimize etmek için en az başka bir geçiş yapılmalıdır. Kokültür için lamellere tohumlanmadan önce% 90 birleşme gereklidir. Bir birleşik p-60, Ts14 için 7 x 105 ve Ts2.5 hücre hatları için10 x 6 ortalama hücre sayısına sahiptir. Ts12 ve Ts14 hücre hatları her 2-3 günde bir geçilmelidir.
2. Test için ihOEG'nin (Ts12 ve Ts14) hazırlanması
NOT: Bu adım, retinal ganglion nöronları (RGN'ler) diseksiyonu ve kokültüründen 24 saat önce yapılmalıdır.
- 12 mm Ø lamelleri 1 h.
boyunca 10 μg/mL poli-L-lizin (PLL) ile tedavi edin: Lameller gece boyunca PLL çözeltisinde bırakılabilir. - Lamelleri 1x fosfat tampon salin (PBS) ile üç kez yıkayın.
- Ts12 ve Ts14 ihOEG hücrelerini p60 hücre kültürü kabından ayırın.
- 15 mL'lik konik bir tüpe 4 mL DMEM/F12-FBS kültür ortamı ekleyin. Temiz su banyosunda 37 °C'de ısıtın.
- Ortamı plakalardan çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x PBS-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile bir kez yıkayın.
- OEG hücrelerine 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 3-5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri bir p1000 pipeti ile toplayın ve bunları adım 3.1'de hazırlanan ortama aktarın.
- 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı arzulayın.
- 1 mL ME10 ortamı ekleyin ve peleti yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometredeki hücre sayısını sayın.
- 80.000 Ts14 hücresi veya 100.000 Ts12 hücresi / kuyusu, 500 μL ME10 ortamında 24 oyuklu plakalardaki lamellerin üzerine tohumlayın.
- 24 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de kültür hücreleri.
3. Retina dokusu diseksiyonu
NOT: RGN kaynağı olarak 2 aylık erkek Wistar sıçanları kullanılır. 24 oyuklu bir hücre çanağının 20 oyuğu için iki retina (bir sıçan). Kullanmadan önce cerrahi malzemeyi otoklavlayın. Papain ayrışma kiti ticari olarak satın alınır (Malzeme Tablosu). Sulandırma için sağlayıcının talimatlarını izleyin. D, L-2-amino-5-fosfonovalerik asidi (APV) 5 mM stokta sulandırın ve alikotları hazırlayın.
- Tahlil gününde aşağıdaki ortamı hazırlayın.
- 5 mL soğuk Earle's Balanced Salt Solution veya EBSS (papain ayrışma kitinin flakon 1'i) içeren bir p60 hücre kültürü kabı hazırlayın.
- Sulandırılmış flakon 2 (papain) papain ayrışma kiti artı 50 μL APV içeren bir p60 hücre kültürü kabı hazırlayın. Ardından, 250 μL sulandırılmış flakon 3 (DNaz artı 5 μL APV) ekleyin.
- Steril bir tüpte, 2.7 mL flakon 1'i 300 μL flakon 4 (albümin-ovomokoid proteaz inhibitörü) ile karıştırın. 150 μL flakon 3 (DNaz) artı 30 μL APV ekleyin.
- 20 mL Nörobazal-B27 ortamı (NB-B27) hazırlayın.
- CO2 ile boğularak bir sıçan kurban edin.
- Bir giyotin ile kafayı keserek kafayı çıkarın; 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve laminer akış başlığına yerleştirmeden önce% 70 etanol püskürtün.
- Farenin bıyıklarını makasla kesin, böylece göz manipülasyonuna müdahale etmezler.
- Bir neşter ile göz boyunca bir kesi yapabilecek kadar göz küresini dışarı çekmek için optik siniri forseps ile kavrayın.
- Lensi ve vitreus mizahını çıkarın ve gözün geri kalan katmanları içeride kalırken (pigment epitel tabakası dahil) retinayı (turuncu benzeri doku) dışarı çekin.
- Retinayı adım 3.1.1'de hazırlanan p60 hücre kültürü kabına yerleştirin.
- Retinayı adım 3.1.2'de hazırlanan p60 hücre kültürü kabına aktarın ve neşter ile yaklaşık 1 mm boyutunda küçük parçalar
- 15 mL'lik bir plastik tüpe aktarın.
- Dokuyu nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 altında, her 10 dakikada bir çalkalama ile 30 dakika inkübe edin.
- Bir cam Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre kümelerini ayırın.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve papaini inaktive etmek için, adım 3.1.3'te hazırlanan çözelti içinde hücre peletini yeniden süspanse edin. (2 göz için 1,5 mL).
- Bu hücre süspansiyonunu 5 mL sulandırılmış şişeye 4 dikkatlice pipetleyin.
- 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Santrifüjleme sırasında, ME-10 ortamını OEG 24 oyuklu hücre plakasından (daha önce adım 2'de hazırlanmış) tamamen çıkarın ve oyuk başına 500 μL NB-B27 ortamı ile değiştirin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL NB-B27 ortamında yeniden süspanse edin.
- M24 plakasının oyuğu başına 100 μL retina hücre süspansiyonu, PLL ile muamele edilmiş veya OEG tek katmanlı lameller üzerine plaka.
- Kültürleri NB-B27 ortamında 96 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.
4. İmmün boyama
- 96 saat sonra, kültür ortamına (600 μL) (PFA nihai konsantrasyonu% 2) 1x PBS'de aynı hacimde% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri 10 dakika boyunca sabitleyin.
- Ortamı ve PFA'yı 24 çok kuyulu plakadan çıkarın ve bir kez daha 1x PBS'ye 500 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. 10 dakika inkübe edin.
- Sabitleyiciyi atın ve 1x PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
- 30-40 dakika boyunca PBS'DE (PBS-TS) %0.1 Triton X-100/%1 FBS ile bloklayın.
- PBS-TS tamponundaki birincil antikorları aşağıdaki gibi hazırlayın: SMI31 (MAP1B ve NF-H proteinlerine karşı) monoklonal antikor (1:500). 514 (MAP2A ve B proteinlerini tanır) tavşan poliklonal antiserumu (1:400).
- Kokültürlere birincil antikorlar ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, antikorları atın ve lamelleri 1x PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın.
- İkincil antikorları PBS-TS tamponunda aşağıdaki gibi hazırlayın: SMI-31 için, anti-fare Alexa Fluor 488 (1:500). 514 için, anti-tavşan Alexa-594 (1:500).
- Hücreleri, karşılık gelen floresan ikincil antikorlarla 1 saat, oda sıcaklığında veya karanlıkta RT ile inkübe edin.
- Lamelleri 1x PBS ile 3 kez karanlıkta 5 dakika boyunca yıkayın.
- Son olarak, lamellerin montaj ortamı (Malzeme Tablosu) ile monte edin ve bunları 4 °C'de tutun.
NOT: Gerektiğinde, DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) ile floresan çekirdek boyama yapılabilir. Montajdan önce, hücreleri karanlıkta DAPI (1x PBS'de 10 μg / mL) ile 10 dakika inkübe edin. Lamelleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve son olarak lamelleri montaj ortamı ile monte edin.
5. Aksonal rejenerasyon miktar tayini
NOT: Numuneler, bir epifloresan mikroskobunun 40x objektifi altında ölçülür. Her tedavi için ölçülmek üzere en az 200 nöron içeren rastgele alanlarda en az 30 resim çekilmelidir. Her deney en az üç kez tekrarlanmalıdır.
- Toplam RGN popülasyonuna göre aksonlu nöronların yüzdesini (SMI31 pozitif nörit) ölçün (nöronal gövde ve dendritlerin MAP2A / B 514 pozitif immün boyaması ile tanımlanır).
- Aksonal rejenerasyon indeksini veya ortalama aksonal uzunluğu (μm/nöron) ölçün. Bu parametre, tanımlanan tüm aksonların uzunluklarının (μm cinsinden) toplamının, bir akson sunup sunmadıklarına bakılmaksızın, sayılan toplam nöron sayısına bölünmesi olarak tanımlanır. Aksonal uzunluk, görüntü yazılımı ImageJ'NIN (NIH-USA) NeuronJ eklentisi kullanılarak belirlenir.
- Uygun yazılımı kullanarak ortalamayı, standart sapmayı ve istatistiksel anlamlılığı hesaplayın.