Method Article

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

June 17th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları seçici olarak uyaran uçucu dalgalar üreterek toplam iç yansıma elde etmek için ayarlamalar yapılır. TIRF görüntülemeden önce, alım parametreleri yapılandırılır ve örnekleme frekansı ayarlanır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

  1. SH-SY5Y hücre kültürü
    NOT: Deneyler insan nöroblastomu SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. SH-SY5Y hücreleri, yüzen kümeler ve yapışık hücrelerin bir karışımı olarak büyür. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için çok önemli olan cam kapağa sıkıca tutturulmuş hücrelere sahip olmak için protokolde bildirilen talimatları (hücre yoğunluğu, bölünme oranı vb.) izleyin.
    1. Başlamadan önce, laminer akışlı biyogüvenlik kabininin altında, uygun miktarda steril fosfat tampon salin (PBS) çözeltisi ve kültür ortamı yapın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

Şekil 1. TIRF mikroskobu kuruldu. TIRF mikroskop sisteminin şematik görünümü ve görüntüsü (iç). Kurulum, Axio Observer Z1 motorlu ters mikroskop (A), çok çizgili 100 mW Argon-iyon lazer (B) ve bir TIRF-kaydırıcı (C) içerir. Lazer ışığı (yeş.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ekipman
Axio Observer Z1Zeiss491912-9850-000ters çevrilmiş microscopehttp://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Çok Çizgili Argon Lazer Lasos 77Lasos00000-1312-752çok hatlı (458/488/514 nm), 100mW argon iyon laserhttp://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Lazer TIRF kaydırıcıZeiss423681-9901-000http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x ObjectiveZeiss421190-9900-000Petrol, NA 1.45 Alfa Planıhttps://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a& id=421190-9900-000&ss=1
CCD Kamera RetigaSRV Hızlı 1394QImaging http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 SmartShutter özellikli optik filtre değiştiriciSutter Instrument Company http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Image ProPlus 6.3 SoftwareMedia Cybernetics nokta seçimi, ROI seçimi, floresan yoğunluğu determinationhttp://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
ExcelMicrosoft foto ağartma düzeltmesi, tam hücre ve tek vezikül analyseshttp://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prizma 4.00GraphPad Software, Inc. istatistiksel analysishttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Total Internal Reflection FluorescenceTIRF MicroscopyNeuroblastoma CellsSynaptic VesiclesEpifluorescence ModeEvanescent WaveAcquisition SettingsSampling FrequencyFluorophore tagged MembranesCritical Angle Adjustment

Related Articles