Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Abstract

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları seçici olarak uyaran uçucu dalgalar üreterek toplam iç yansıma elde etmek için ayarlamalar yapılır. TIRF görüntülemeden önce, alım parametreleri yapılandırılır ve örnekleme frekansı ayarlanır.

Protocol

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

1. SH-SY5Y hücre kültürü
   NOT: Deneyler insan nöroblastomu SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. SH-SY5Y hücreleri, yüzen kümeler ve yapışık hücrelerin bir karışımı olarak büyür. Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için çok önemli olan cam kapağa sıkıca tutturulmuş hücrelere sahip olmak için protokolde bildirilen talimatları (hücre yoğunluğu, bölünme oranı vb.) izleyin.
   1. Başlamadan önce, laminer akışlı biyogüvenlik kabininin altında, uygun miktarda steril fosfat tampon salin (PBS) çözeltisi ve kültür ortamı yapın.
      1. 150 mM Sodyum Klorür (NaCl), 24 mM fosfat tamponu, pH 7.4 konsantrasyonlarında 50 ml PBS yapın. Çözeltiyi filtreleyin.
      2. Dulbecco'nun yüksek glikoz,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 μg / ml), L-glutamin (2 mM) ve sodyum piruvat (1 mM) içeren modifiye Eagle ortamından (DMEM) 50 ml hücre ortamı yapın. Çözeltiyi filtreleyin.
   2. Tüm büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri 3 ml PBS ile yıkayın.
   3. Hücreleri 2 ml %0.05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (6 cm'lik bir Petri kabı için) ile 37 °C, %5 CO_2, 5 dakika inkübe edin ve hücreleri bir pipet kullanarak ayırın.
   4. 2 ml DMEM ekleyerek tripsini inaktive edin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme ile hücreleri toplayın.
   5. Süpernatantı çıkarın, pelete 1 ml DMEM ekleyin ve hücreleri tek hücreli bir süspansiyona dağıtmak için çözeltiyi yeterince yukarı ve aşağı pipetleyin.
   6. Bunları 3 ml tam ortam içeren 6 cm çapında yeni bir Petri kabına 1:4 oranında bölün. Kültürdeki hücreleri, 6 cm çapındaki Petri kaplarında% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de tutun. Haftada bir kez veya yüzey alanının% 80 - 90'ını kapladıklarında alt kültür.
2. Görüntüleme için SH-SY5Y hücre kaplaması
   1. TIRFM deneyleri için plaka hücreleri cam kapaklar üzerine yerleştirilir. 0,17 ± 0,005 mm kalınlığa ve 1,5255 ± 0,00015 kırılma indisine sahip cam kapaklar kullanın. Başlamadan önce cam lamelleri aşağıdaki gibi hazırlayın:
      1. Cam kapakları gece boyunca %90 etanol (O/N) ile temizleyin.
      2. Damıtılmış suda iyice durulayın (üç değişiklik damıtılmış su). Kurutma fırınında kuru cam kapaklar.
      3. Kapakları cam Petri kaplarına yerleştirin ve önceden ısıtılmış 200 °C fırında 3 saat sterilize edin.
   2. Transfeksiyondan bir gün önce, her bir lameli 3,5 cm'lik bir Petri kabına koyun, 1 ml kültür ortamı ekleyin ve 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
   3. Hücreleri 1.1.3 - 1.1.5 adımlarında açıklandığı gibi tripnize edin, hücre peletini 1 ml tam ortamda askıya alın ve sayın. 3 x 10⁵ hücre/kuyu elde etmek için her Petri kabına eklenecek doğru hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın. Bu yoğunluk, optimal hücre büyümesi ve verimli transfeksiyon için gereklidir. 37 °C'de %5 CO₂ inkübatör O/N'de inkübe edin.
3. SH-SY5Ypolietilenimin (PEI) ile transfeksiyon
   NOT: Sinaptik vezikül dinamiklerini görselleştirmek için sinapto-pHluorin içeren bir pCB6 vektörü kullanılmıştır. Sinapto-pHluorin, yeşil floresan proteininin (GFP) ve veziküler membran proteini sinaptobrevin 2'nin pH'a duyarlı bir varyantının çerçeve içi füzyonu ile üretilmiştir. Yapı, nöronlar içindeki sinaptik vezikül özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır.
   1. Transfeksiyona başlamadan önce, aşağıdaki çözeltilerden 10 ml yapın. Solüsyonları en fazla 1 ay saklayın.
      1. 150 mM NaCl çözeltisi yapın. 0.01 N hidroklorik asit (HCl) ile pH 5.5'e ayarlayın.
      2. 150 mM NaCl çözeltisi içinde% 10 polietileniminde (PEI; 25 kDa doğrusal) bir PEI çözeltisi yapın. Çözeltinin pH'ı 8.8'e yükselir. Kaplamadan 24 saat sonra pH'ı 0,01 N HCl ile 7,8'e ayarlayın.
   2. 24 saat sonra ortamı çıkarın ve 1,5 ml tam ortam ile yenileyin. Hücreleri %5 CO₂ inkübatörde 37 °C'de tutun.
   3. Laminer akışlı biyogüvenlik kabini altında, 1,5 ml'lik bir mikrofüj tüpünde, 3,5 cm'lik Petri kabı başına 25 μl 150 mM NaCl çözeltisine ve 100 μl PEI çözeltisine 3 μg plazmit DNA ekleyin.
   4. 10 saniye vorteks yapın, ardından DNA / PEI karışımını oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
   5. DNA/PEI karışımını, hücreli lameller içeren Petri kabına dikkatlice ekleyin ve reaktifi Petri kabına eşit olarak dağıtmak için hafifçe sallayın.
   6. 4 saat sonra, ortamı değiştirin ve O/N hücrelerini 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde inkübe edin. Transfeksiyondan 24 - 48 saat sonra görüntüleme deneyleri yapın.

2. TIRFM ile Hücre Görüntüleme

1. Görüntüleme kurulumu
   1. {{}}Şekil 1'da açıklanan kurulumla TIRF görüntüleme gerçekleştirin. Motorlu bir ters çevrilmiş mikroskop (Şekil 1, iç A), lazer kaynağı (Şekil 1, iç B) ve TIRF kaydırıcısını (Şekil 1, iç C) içerir. Yüksek sayısal açıklık (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X yağ, daldırma objektifi ile TIRFM aydınlatmasına ulaşın.
   2. TIRFM aydınlatması için çok satırlı (458/488/514 nm) 100 mW argon iyon lazer kullanın. Tek modlu bir fiber kullanarak, doğrusal polarize lazer ışığını TIRF kaydırıcısı aracılığıyla ışın yoluna sokun. TIRF kaydırıcısını, yansıyan ışık huzmesi yolunun ışık alanı diyafram düzlemine yerleştirin.
      1. Geniş alan aydınlatması için, mikroskobu geleneksel bir cıva kısa ark lambası HBO beyaz ışığına bağlayın. Kaydırıcıdaki polarizasyonu koruyan çift prizma, TIRF aydınlatması ve beyaz ışığın aynı anda kombinasyonunu sağlar.
   3. Lazer ışığını, bir filtre tekerleğine monte edilmiş ve lazer yoluna sokulan bir uyarma filtresi (bant genişliği 488/10 nm) ile filtreleyin. Lazer aydınlatmanın hızlı bir şekilde kontrol edilmesini sağlamak için yüksek hızlı, yazılım kontrollü bir deklanşör kullanın. pHluorin analizi için bant geçiren 525/50 nm emisyon filtresi monte edin. Image ProPlus yazılımı ile soğutulmuş bir Hızlı CCD kamerada dijital görüntüler (512 x 512 piksel) yakalayın.
2. TIRF aydınlatmasının elde edilmesi (Şekil 2)
   1. Lazerleri, bilgisayarı, kamerayı, filtre tekerleğini ve deklanşör denetleyicilerini açın; Ardından, lazerlerin ısınması ve stabilize olması gerektiğinden deneye başlamadan önce 20 dakika bekleyin.
   2. Görüntülemeden önce, aşağıdaki çözümlerin uygun hacmini yapın.
      1. 125 mM NaCl, 5 mM Potasyum klorür (KCl), 1.2 mM Magnezyum sülfat (MgSO₄), 1.2 mM Potasyum dihidrojen fosfatta 50 ml Krebs (KRH) çözeltisi yapın (KH₂PO₄), 25 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (pH 7.4'e tamponlanmış), 2 mM Kalsiyum klorür (CaCl₂), ve 6 mM glikoz.
      2. 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 25 mM HEPES (pH 7.4'e tamponlanmış), 2 mM CaCl₂ ve 6 mM glikozda 10 ml KCl-KRH çözeltisi (pH 7.4) yapın.
   3. Kesilmiş hücrelerin bulunduğu cam kapağı çıkarın ve uygun görüntüleme odasına yerleştirin. Hazneyi birleştirin ve camın ortasına 500 μl KRH çözeltisi ekleyin.
   4. Objektifin üzerine yağ ekleyin. Görüntüleme odasını mikroskobun tablasına yerleştirin ve objektifi cam lamel altına yerleştirin. Güvenli kapağı numunenin üzerine yerleştirin.
   5. Epifloresan modunda, lamel (üst yüzey) üzerine odaklanın ve oda merkezine yerleştirilen transfekte edilmiş hücreleri seçin. Floresan sinyali 80 msn'nin altında bir maruz kalma süresi kullanılarak net bir şekilde kaydedilebilen hücreleri seçin.
   6. Yazılım kontrolü altında, canlı modda TIRF aydınlatmasına geçin.
   7. TIRF konfigürasyonunu ayarlamak için, numune kapağı üzerindeki objektiften çıkan ışının konumunu kontrol edin (Şekil 2B). Işın objektif merceğin merkezine yerleştirildiğinde (Şekil 2A, sol), TIRF numune kapağının ortasında bir nokta görünür (Şekil 2B, sol) ve hücre epifloresan modunda görüntülenir (birkaç odak düzlemi, yüksek arka plan floresansı; Şekil 2C, sol).
   8. Kritik açıya ulaşmak için, odaklanılan noktayı Y yönünde hareket ettirin (ileri veya geri; Şekil 2B, ortada) TIRF kaydırıcısındaki açı ayar vidasını kullanarak (Şekil 1C). Işın, numune düzlemi üzerinde kritik açıdan daha büyük bir açıyla birleştiğinde (Şekil 2A, sağ), nokta kaybolur ve numune örtüsünün ortasında düz, ince, odaklanmış bir çizgi belirgindir (Şekil 2B, sağ).
   9. TIRF açısına ince ayar yapmak için hücre örneğini kullanın (Şekil 2C). Videodaki floresan görüntüsünü izleyin. Bu aşamada, epifloresan benzeri bir görüntü hala görülebilir. TIRF koşulu elde edilene kadar vidayı yavaşça hareket ettirin: hücrenin yalnızca bir optik düzlemi odaktadır (yani, lamel ile temas halinde olan plazma zarı). Bu, yüksek kontrastlı düz bir görüntü elde edilmesini sağlar (Şekil 2C, sağ).
3. Örnek görüntüleme
   1. Tek kanallı zaman atlamalı denemeyi ayarlayın. Foto ağartmayı en aza indirmek için, düşük pozlama süresi ve yüksek kazanç kullanarak görüntüyü yakalayın. Uygun maruz kalma süreleri 40 - 80 msn arasındadır. 1 - 2 Hz örnekleme frekansında görüntüler elde edin. Vezikül kinetiği, daha yüksek frekansta (10 Hz) örnekleme ile daha iyi değerlendirilebilir. Normal gözlem süresi genellikle 2 dakikadır.

Results

Şekil 1. TIRF mikroskobu kuruldu. TIRF mikroskop sisteminin şematik görünümü ve görüntüsü (iç). Kurulum, Axio Observer Z1 motorlu ters mikroskop (A), çok çizgili 100 mW Argon-iyon lazer (B) ve bir TIRF-kaydırıcı (C) içerir. Lazer ışığı (yeş...

Materials