Bir Fare Yavrusu Striatumunda Gen Manipülasyonu için Viral Bir Vektörün Stereotaktik Mikroenjeksiyonu

Özet

Kaynak: Chen, S., et al., Yenidoğan Fare Beyinlerinin Striatal Hücrelerinde Genetik Manipülasyon için Stereotaksik Cerrahi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, Cre rekombinaz ve yeşil floresan proteini veya GFP'yi kodlayan bir viral vektörün, bir loxP ile çevrili STOP kasetini eksize ederek, kırmızı floresan proteinini veya RFP'yi bir raportör olarak aktive ederek gen manipülasyonu elde etmek için genetik olarak değiştirilmiş bir fare yavrusunun striatumuna stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1.

1. Mikroenjeksiyon: Stereotaksik aleti %70 etanol ile iyice silerek steril cerrahi hazırlayın. Cerrahi aleti sterilize etmek için% 70 etanole batırın.
2. Yavrunun kafasını %70 etanol ile ovalayın. Kafatasındaki yer işareti lambdasını bulun ve lambdayı bir işaretleyici kalemle işaretleyin. İğne ucunu lambdaya doğrultun ve ön-arka (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatlarını sıfır olarak ayarlayın.
3. Enjeksiyon kolunu hedef bölgenin X ve Y koordinatlarına göre hedef bölgeye hareket ettirin. Doğum sonrası gün (P) 2 yavrularının striatumu için koordinatlar: AP, lambdanın +2.4 mm önünde; ML, orta hattan ±1.0 mm yanal; dorsal-ventral (DV), kafatasından -1.7 mm. PE10 tüpündeki hızlı yeşil boyanın konumunu bir kalemle işaretleyin.
4. Deriye ve kafatasına nüfuz etmek için 30G enjeksiyon iğnesini yavaşça aşağı indirin ve ardından iğne ucunu kafatasının yüzeyinde durana kadar yukarı kaldırın. DV koordinatını sıfıra ayarlayın.
5. 30G enjeksiyon iğnesini, hedef bölgenin DV koordinatına ulaşana kadar yavaşça aşağı indirin. Parankimin normal şekline dönmesi için 1 dakika bekleyin. Daha sonra mikroenjeksiyon programını (100 nL/dk) çalıştırın.
6. Virüs sıvısının beyne enjekte edildiğinden emin olmak için hızlı yeşil boya işaretinin PE tüpünde hareket ettiğinden emin olun.
7. Mikroenjeksiyonun sonlandırılmasından sonra 1 dakika bekleyin ve ardından iğneyi 30 saniye içinde DV derinliğinin 1/2 yüksekliğine yavaşça ve aşamalı olarak getirin. 30 saniye sonra, iğneyi yavrunun kafasından yavaşça çekin.

2. Yavrunun Ameliyat Sonrası İyileşmesi

:

1. Yavruyu 33 ° C'lik bir inkübatörde 20 dakika ısıtın. Yavru sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar her 5 dakikada bir yavrunun hipotermi anestezisinden iyileşmesini kontrol edin.
2. Yavru tamamen iyileştikten sonra yavruyu baraja geri koyun.

Malzemeler