Ekzositik olayların görselleştirilmesi için toplam iç yansıma floresan mikroskobu

Özet

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, kortikal nöronlardaki ekzositik olayları görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunu göstermektedir. pH'a duyarlı bir yeşil floresan protein (GFP) markörü, vezikül füzyonu üzerine floresan yapar ve zaman atlamalı görüntülemede membran-proksimal ekzositozu yakalayan seçici TIRF uyarımı ile floresan olur.

Protokol

1. Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Ekzositik Olayların Görüntülenmesi

Not: Bu protokol, sıcaklığı, nemi ve karbondioksiti (CO₂) korumak için bir çevre odası, epifloresan aydınlatma ile donatılmış ters çevrilmiş bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, yüksek büyütme / yüksek sayısal açıklık (NA) TIRF hedefi, otomatik bir XYZ dahil olmak üzere özel mikroskopi ekipmanı gerektirir aşama ve hassas bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) dedektörü. Bu protokol, 100x 1.49 NA TIRF objektif, katı hal 491 nm lazer ve elektron çarpan CCD (EM-CCD) ile donatılmış tam otomatik bir ters mikroskop kullanır. Tüm ekipmanlar görüntüleme v....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35mm cam tabanlı canlı hücre görüntüleme tabakları	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	1mg/mL poli-D-lizin ile kaplanmalı ve hücreler kaplanmadan önce durulanmalıdır
Olympus IX81-ZDC2 ters mikroskop	Olympus
Lambda LS xenon lamba	Sutter Instruments Company
Çevre aşaması en iyi kuluçka makinesi	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF hedefi	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell TIRF kontrol yazılımı	Olympus		Yazılımı kontrol etmek için kullanılır TIRF görüntüleme için lazerler
Fiji (Resim J)	NIH	ImageJ sürüm 1.49t
Tavşan poliklonal anti-insan VAMP2	Hücre sinyalizasyonu	11829
Poli-D-lizin	Sigma	p-7886	1mg/mL'de steril suda çözülür