$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Ekzositik Olayların Görüntülenmesi
Not: Bu protokol, sıcaklığı, nemi ve karbondioksiti (CO2) korumak için bir çevre odası, epifloresan aydınlatma ile donatılmış ters çevrilmiş bir toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, yüksek büyütme / yüksek sayısal açıklık (NA) TIRF hedefi, otomatik bir XYZ dahil olmak üzere özel mikroskopi ekipmanı gerektirir aşama ve hassas bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) dedektörü. Bu protokol, 100x 1.49 NA TIRF objektif, katı hal 491 nm lazer ve elektron çarpan CCD (EM-CCD) ile donatılmış tam otomatik bir ters mikroskop kullanır. Tüm ekipmanlar görüntüleme ve lazer kontrol yazılımı ile kontrol edilir. Görüntüleme protokolünün başlamasından önce, çevre odasını, sahneyi, lambayı, bilgisayarı ve kamerayı açın.
- Görüntüleme yazılımında hedefi seçin. Amaç yerine oturduktan sonra, hedef ısıtıcısını bileziğin etrafına sabitleyin.
- Sahne inkübatörünü sahne alanı yuvasına sabitlemeden önce hedefin tamamen indirildiğini onaylayın. Dökülmeleri önlemek için damıtılmış suyu sahne inkübatörü girişlerine eşit şekilde dökün.
- Kuluçka sistemini açın. CO2 tankına giden vanayı açın ve üreticinin talimatlarına göre basıncın sistem için uygun olduğunu onaylayın. Haznenin %5 CO2 ve 37 °C'ye ulaşması için biraz zaman tanıyın. Görüntüleme kabını eklemeden önce, objektif üzerinde su yoğunlaşmasını önlemek için inkübatöre boş bir tabak yerleştirin.
- Lazer kaynağını açın.
- Sahne inkübatörünü açın ve lense daldırma yağı ekleyin. Numuneyi inkübatöre yerleştirin ve stabilite kolları veya bir tabak ağırlığı ile sabitleyin. Yağ, numunenin alt kısmıyla temas edene kadar hedefi kaldırın. İletilen ışık aydınlatmasına geçin ve oküler aracılığıyla nöronal odak düzlemini bulun.
- Lazer yazılımını başlatın ve lazer kontrol yazılımına bağlayın. Aydınlatmayı geniş alana ayarlayın ve hedefi seçin (100x 1,49 NA TIRF önerilir). Numunenin kırılma indisini ayarlayın (hücreler ~1.38). 491 nm lazer için "TTL" (Transistör-Transistör Mantığı) seçeneğinin işaretini kaldırarak lazer yoğunluğunu ayarlayın. Kaydırıcıyı 100'e ayarlayın, ardından %20 ile %40 arasında bir değere geri getirin. "TTL"yi yeniden kontrol edin.
- İletilen ışık aydınlatmasında tekrar s'ye odaklanın. Görüntüleme yazılımına gidin, 491 nm lazer aydınlatmayı seçin ve deklanşörü açın. Lazerin tavandaki odak noktasını ince bir şekilde ayarlayın ve kondansatör çıkarılmış olarak kapalı alan diyaframının merkezine ortalayın. Lensi çizmemek için kondansatörü optik tezgahın üzerine baş aşağı yerleştirin.
- Kondansatörü değiştirin, TIRF yazılımına gidin ve penetrasyon derinliğini (PD) 110 nm olarak ayarlayın. Ardından, görüntüleme için geniş alan aydınlatmasından TIRF aydınlatma moduna geçin.
- Epifloresan ışık kaynağı ile geniş alan epifloresan kullanarak oküler boyunca vezikülle ilişkili membran proteini 2 (VAMP2)-flüorin eksprese eden hücreleri bulun.
- Fotoağartmayı ve fototoksisiteyi azaltmak için minimum pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu kullanarak sinyal-gürültü oranını ve dinamik aralığı en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme parametrelerini (pozlama süresi, kazanç ve lazer gücü) ayarlayın (örneğin, %30 maksimum lazer gücünde 15 - 30 kazanç ile 50 - 100 msn arasında maruz kalma).
- Hücre başına sürekli otomatik odaklamayı ayarlayın. 5 dakika boyunca her 0,5 saniyede bir gerçekleşen çekim ile zaman atlamalı bir görüntü seti elde edin. Netrin-1 ile uyarılan durum için, laminer akış başlığındaki hücre kabına 500 ng / ml netrin-1 ekleyin ve görüntülemeden önce çanağı 1 saat boyunca inkübatöre geri koyun.