Bir Sıçanda Nöronal Aktivitenin İnhibisyonu ve Elektrofizyoloji Kullanılarak Tespiti

Özet

Kaynak: Lai, J., et al. Kemirgen beyninde inhibitör ajanların eşzamanlı elektrofizyolojik kaydı ve mikro enjeksiyonları. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, sıçan superior colliculus'ta eşzamanlı nöronal kayıt ve inhibisyon için mikroenjeksiyon tabanlı bir tekniği göstermektedir. Prosedür, stereotaksik hedeflemeyi, kafatası delmeyi ve nöronal aktiviteyi kaydederken inhibe edici bir nörotransmitter sağlayan bir injectrodun yerleştirilmesini içerir. Işık stimülasyonu aksiyon potansiyellerini uyandırırken, ilaç mikroenjeksiyonu nöronal uyarılabilirliği baskılar. Nörotransmitter seviyeleri düştükçe, nöronal aktivite taban çizgisine geri döner ve hem inhibisyon hem de iyileşme çalışmasını sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kayıt Enjeksiyonlu Pipetin Montajı

1. Bir pipet çektirme kullanarak yaklaşık 7 cm uzunluğunda bir cam kılcal damarı (1 mm dış çap) çekin.
2. Kılcal damarın ucunu kırın ve diyaframı ışık mikroskobu altında kontrol edin. İç çapın 30 μm ila 40 μm arasında olduğunu onaylayın.
3. Cam pipetin konik olmayan ucundan yaklaşık 1 cm çıkıntı yapacak şekilde cam kılcal damara 7 cm uzunluğunda gümüş bir tel yerleştirin.
4. Fazla filamenti cam kılcal damara dik olarak bükün.
5. 30 G'lik bir hipodermik iğnenin şaftına bir damla esnek plastik yapıştırıcı sürün.
6. Şekil 30'de sunulan şemalara göre cam pipete 1 G'lik bir hipodermik iğne yerleştirin.
7. Cam pipet ile hipodermik iğne arasındaki bağlantıdan uygun bir sızdırmazlık sağlamak için ikinci bir yapıştırıcı tabakası ekleyin.
8. Yapıştırıcının düzgün bir şekilde kürlenmesini sağlamak için pipeti ucu yukarı bakacak şekilde yaklaşık 12 saat kurumaya bırakın. Bitmiş sonuç Şekil 2'de gösterilmiştir.

NOT: Bu prosedür akut deneylerde yapılır ve pipet ucunun sterilizasyonu gerekli değildir.

2. Hayvan Hazırlama

1. : Fareyi bir anestezi kutusuna koyun.
2. 5 ila 10 dakika boyunca% 4 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin.
3. Vücut ısısını 37 ° C'de tutmak için hayvanı bir ısıtma yastığı ve bir rektal prob ile stereotaksik bir masaya yerleştirin. % 2 izofluran ile anesteziyi sürdürmek için bir burun konisi kullanın. Kulak çubukları ve bir diş tutucu kullanarak farenin kafasını sabitleyin.
4. Göz bebeği genişlemesine yardımcı olmak için% 1 Atropin damlası içeren oftalmik merhem veya göz damlası uygulayın. Kuruluğu önlemek için yaklaşık her 30 dakikada bir kayganlaştırıcı damlalar uygulayın.
5. Kafayı tıraş edin ve% 10 povidon-iyot ile temizleyin.
6. Lokal anestezi için, cildi yukarı kaldırarak ve iğnenin ucunu sokarak kafa derisinin altına 2-3 yerde 0.5 ml% 2'lik lidokain enjekte edin.
7. Bir ayak parmağını kıstırarak ve hareket eksikliğini gözlemleyerek yeterli bir anestezi seviyesini onaylayın. Ek olarak, normal değerler (300 ila 400 atım/dk) içinde olduğundan emin olmak için kalp atış hızını izleyin.
8. Hem koronal hem de sagital dikişleri ortaya çıkarmak için kafa derisini # 10 neşter bıçağı ile medyan boyunca düz bir çizgide kesin.
9. Kafatasını kaplayan dokuyu cerrahi bir spatula ile kenara iterek Lambda ve Bregma noktalarını ortaya çıkarın.
10. Kafatasını, Bregma ve Lambda konumları aynı düzlemde olacak şekilde düzleştirin.
11. Referans noktasını ayarlamak için, Bregma'nın hemen üzerine yerleştirmek için monte edilmiş bir cam tüpe sahip stereotaksik bir cihaz kullanın. Bu, antero-posterior ve medial-lateral ölçüm koordinatları için "sıfır" olacaktır.
12. Stereotaksik montajı gerekli koordinatlara hareket ettirerek ilgi noktasını ayarlayın, stereotaksik koordinatları not edin ve hedef alanın etrafına kraniyotominin nerede yapılacağını gösteren bir kare çizin.
13. Kemik malzemesini yavaşça çıkarmak için işaretli kare boyunca yavaşça sterilize edilmiş bir matkap ucu olan bir cerrahi matkap kullanın. Aynı bölgede çok uzun süre delmemeye dikkat edin, çünkü ısı üretecek ve kortekste lezyonlara neden olacaktır.
14. Kraniyotomiyi sınırlayan kemik yeterince inceldiğinde, korteksi ortaya çıkarmak için kraniyal bölümü cımbızla dikkatlice çıkarın.
15. Doku kurumasını önlemek için açıkta kalan korteksi sık sık yapay beyin omurilik sıvısı ile yıkayın.
    NOT: Enjeksiyonun ucu nüfuz edecek kadar sağlam olduğu için sıçan üzerinde dura mater çıkarılması gereksizdir.

3. Enjeksiyon Sisteminin Doldurulması ve Montajı

:

1. 5-10 μl mikroşırıngayı mineral yağ ile aspire ederek doldurun.
2. Hipodermik iğneyi sabit cam pipet ile %0,5 Chicago Sky Blue (CSB) ve 300 μM γ-aminobütirik asit (GABA) çözeltisi veya %0,5 CSB içeren %2 lidokain çözeltisi ile doldurun. Tüm çözeltileri tuzlu su ile seyreltin.
   1. Bol miktarda madde olması durumunda, normal bir şırınga kullanarak doldurun ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için olağan önlem tekniklerini kullanın.
   2. Daha pahalı maddeler söz konusu olduğunda, enjeksiyonu doldurmak için mineral yağ kullanın ve kimyasal ajan daha sonra aspirasyon ile verilebilir. Mineral yağ ve su arasındaki yoğunluk farkı nispeten yüksek olduğundan, bu madde sulu çözeltilerin enjeksiyonu için iyi bir adaydır.
      NOT: İki sıvı arasındaki ayrımı doğrulamak için bir boya eklenebilir.
3. Enjeksiyon pipetini doldurmak için, 1 ml'lik bir şırıngayı aspirasyon yoluyla solüsyonla doldurun ve ardından solüsyonu yavaşça enjeksiyon pipetine enjekte edin.
4. Şekil 1'de gösterilen bölgelerdeki sızıntılara dikkat edin, bu alanları temiz bir şekilde temizleyin ve solüsyonu şırınga ile yavaşça enjekte ederek sızıntıları gözlemleyin.
5. 1 ml şırıngayı çıkarın. Bunu yaparken, vakumun çözeltiyi enjeksiyon pipetinden çıkarmaması için piston üzerinde hafif bir baskı uyguladığınızdan emin olun.
6. Mikroşırıngayı aspirasyon yoluyla mineral yağ ile doldurun ve doldurulmuş enjeksiyon pipetine sıkıca takın, ardından monte edilmiş enjeksiyondan fazla çözeltiyi gazlı bezle dikkatlice silin.
7. Cam pipetin ucunda küçük bir damla oluştuğunu görecek kadar küçük bir hacim enjekte ederek ucun tıkalı olmadığını doğrulayın.
8. Enjeksiyonu mikro pompa sistemine monte edin ve iyi sabitlendiğinden emin olun.
9. Enjeksiyon ucunu dikkatlice hedef koordinatlara yerleştirin ve ucu korteksin yüzeyine indirin.
10. Uygun anatomik koordinatları kullanarak stereotaksik aparatı kullanarak enjeksiyonu hedef yapıya (bu durumda superior colliculus) yavaşça indirin.
11. Doku kurumasını önlemek için açıkta kalan korteksi ılık agar ile örtün.

4. Enjeksiyon ve Tersinir İnaktivasyon

:

1. Mikroenjeksiyon pompasını 40 nl / dk'da 400 ila 800 nl enjekte edecek şekilde ayarlayın ve enjeksiyonu başlatmak için Çalıştır'a basın. Ani artış oranının enjeksiyon sırasında bir azalma göstereceğini unutmayın.
   NOT: Deney düzeneğinde, nöral aktivite, GABA uygulamasının bitiminden sonraki bir saat içinde geri kazanılmıştır. Enjeksiyonu gerçekleştirmek için mikroenjeksiyon şırıngasına basınç uygulamak için kalibre edilmiş herhangi bir mekanik cihaz kullanılabilir.
2. Elektrofizyolojik verilerin elde edilmesinden sonra, yerel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan bir yöntem kullanarak ötenazi yapın.

Sonuçlar

Şekil 1: Injectrode düzeneğinin şematik gösterimi. Bir cam pipet (D) içinde gümüş bir tele (C) yapıştırılmış 30 G'lik bir hipodermik iğneden (B) oluşan kayıt enjeksiyon pipetine bir mikro şırı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Enjeksiyon pompası (UltraMicroPump III)	WPI
Enjeksiyon konsolu (Micro4 Denetleyici)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton şırınga	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	5 ila 10 μL arasındaki şırıngalar kullanılır
Jel siyanoakrilat yapıştırıcı	Krazy Glue	KG86648R	Jel formunun 30G hipodermik iğnenin şaftına uygulanması daha kolaydır
Cam pipetler	WPI	#TW100F-4	İnce duvarlı, 1 mm OD, 0,75 mm iç çap kullanılan filament pipetlerle
720 İğneli Pipet Çektirme	Kopf	720
Gümüş tel	A-M Systems, Inc.	782500	Çıplak 0.010"

#UMP3