Gen Ekspresyonunu Değerlendirmek için Fare Omuriliğinde Subpial Gen İletimi

Özet

Kaynak: Tadokoro, T., et al. Yetişkin Farelerde Subpial Adeno İlişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, farelerde omuriliğe gen iletimi için bir subpial enjeksiyon tekniğini göstermektedir. Prosedür, dura materyalin açığa çıkarılmasını, pia materyalin delinmesini ve floresan protein eksprese eden bir gen taşıyan rekombinant adeno-ilişkili bir virüsün (rAAV) subpial boşluğa enjekte edilmesini içerir. Enjeksiyon ve geri kazanımı takiben virüs, omurilik hücrelerinde gen ekspresyonunu kolaylaştırarak hedef gen ekspresyonunun incelenmesini sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Genel Hayvan ve Cerrahi Hazırlık

1. Cerrahi işleme başlamadan önce virüsü çözün (AAV9-UBI-GFP [UBI: Ubiquitin Promotörü, GFP: Yeşil Floresan Protein]; 5 μL alikotlar). Dekstran tozunu damıtılmış suda karıştırarak% 5'lik bir dekstran (10.000 MW) çözeltisi hazırlayın. Virüs solüsyonunu %5 dekstran solüsyonu 1:1 ile %2,5'lik bir son dekstran konsantrasyonuna kadar karıştırın.
   1. Virüs solüsyonunu buzda (4 °C) saklayın.
2. Yetişkin C57BL / 6J fareleri kullanın (erkek ve dişi, 20-30 g). Fareleri %5 izofluran (O₂, 1 L / dk'da) kullanarak uyuşturun ve solunum hızına ve pençe çimdikleme tepkisine bağlı olarak ameliyat sırasında burun konisi ile %2-3 inhale izofluranda (O₂, 1 L / dk'da) tutun.
3. Hayvanların sırtını tıraş makası ile tıraş edin ve cildi% 2 klorheksidin ile temizleyin.
4. Kronik iyileşme çalışmalarında, sıkı bir steril teknik izleyin.
5. Lomber subpial enjeksiyonlar yapılacaksa, Th8-L1 omurlarını kaplayan cildi bir neşter ile kesin ve paravertebral kası Th10-12 omurga omurlarından makas kullanarak ayırın.
   1. Fare omurga kelepçelerini kullanarak hayvanı standart bir stereotaksik çerçeveye monte edin.
   2. Th10-12 omurlarının laminasının her iki tarafını bir diş matkabı (matkap ucu: 0,9 mm, hız: 20.000 rpm) kullanarak çatlaklar oluşana kadar tıraş edin.
   3. Kırık kemik parçalarını forseps ile çıkarın ve lomber omuriliğin dorsal yüzeyini ortaya çıkarın.
   4. 30 G paslanmaz çelik iğne ve forseps kullanarak durayı yaklaşık 1 cm kesin.

2. Pial Membranın Açılması ve AAV9 Teslimatı için Subpial İğnenin Yerleştirilmesi

1. 34 G pia nüfuz eden iğneyi bir cam kılcal tutucu kullanarak bir XYZ manipülatörünün Z koluna monte edin (Şekil 1A ve B).
   NOT: Pia nüfuz eden iğneyi üretmek için, 34G iğnenin orijinal eğimli ucu, elmas aşındırıcı plakalı bir cam kılcal eğim kullanılarak keskinleştirilir - kaba (5,0 μm ila 50 μm uç) boyutlar) ve 15 - 20 ° taşlama açısı. İğnenin ucu (1 mm uzunluk, uçtan ölçülür) daha sonra nazikçe yaklaşık 90° bükülür (Şekil 1B, sol uç).
2. 8-10X büyütmeye ayarlanmış bir cerrahi diseksiyon dürbünü kullanarak, X kolunu kullanarak piaya nüfuz eden iğne ile piaya yaklaşık 1 mm nüfuz edin (Şekil 1C).
   1. Penetran iğnenin doku yüzeyine açısını 5-10°'de tutun.
3. Pia açıldıktan sonra, pia-penetran iğneyi X-arm'ı kullanarak subpial boşluktan (Şekil 1D) yatay olarak çıkarın.
   NOT: Kan damarı gibi bir yer işaretinin nüfuz ettiği bölgeyi hatırlayın.
4. PE-10 veya PE-20 tüplü enjeksiyon iğnesine bağlı 50 μL'lik bir mikroşırınga kullanarak AAV9-UBI-GFP virüslü künt bir 36G enjeksiyon iğnesi yükleyin.
5. İğneyi, bir cam kılcal tutucu kullanarak ikinci bir XYZ manipülatörünün (Şekil 1A ve B) Z koluna monte edin (Şekil 1B, sağ uç).
   NOT: Subpial AAV9 enjeksiyon iğnesini üretmek için, 36 G'lik bir iğnenin kör ucu, keskin kenarları çıkarmak için kaba (5,0 μm ila 50 μm uç boyutları) elmas aşındırıcı plakalı bir cam kılcal kanat parlatıcı kullanılarak parlatılır. İğnenin ucu (uçtan ölçülen 2-3 mm uzunluk) daha sonra nazikçe yaklaşık 90°'ye bükülür. Pia penetran ve subpial enjeksiyon iğneleri 1-2 cm uzunluğunda 20G slave paslanmaz çelik boruya (iğnenin ucundan 10 mm) yerleştirilir ve epoksi ile yapıştırılır. Cam kılcal tutucuya güvenli bir bağlantı için 20 G (0,91 mm çapında) boru kullanılması gerekir.
6. İkinci manipülatörün X, Y ve Z kollarını manipüle ederek, AAV9 enjeksiyon iğnesinin ucunu pia'nın nüfuz ettiği bölgeye yerleştirin ve ardından X kolunu kullanarak önceki piyal zar açıklığından subpial boşluğa yaklaşık 2-3 mm ilerletin ( Şekil 1E ve F).
   NOT: 1) AAV9-UBI-GFP, daha önce bildirilen protokollere göre hazırlanmıştır, ve son titreler mL (gc/mL) başına 1.2 x^{10 13} genom kopyasına ayarlanır. 2) Kolayca tanımlanabildiği için piyal açıklığın yerini işaretlemeye gerek yoktur (Şekil 1D).
7. AAV9-UBI-GFP'yi (1.5, 3 veya 5 μL) 50 μL'lik bir mikroşırınga kullanarak subpial boşluğa enjekte edin (deney grupları için Tablo 1'e bakınız).
8. AAV9-UBI-GFP enjeksiyonu tamamlandıktan sonra enjeksiyon iğnesini subpial boşluktan çıkarın.
9. 4.0 monofilament sütür ve cerrahi klipsler kullanarak kas ve cildi kapatın.
   NOT: Açık omurun kapatılmasına gerek yoktur.
10. Hayvanların bir ısıtma yastığı üzerinde iyileşmesine izin verin.
11. Ağrı kontrolü için, ameliyattan sonraki 2-3 gün boyunca her 12 saatte bir Buprenorfin 0.05 mg / kg / sc enjekte edin.

Tablo 1: Deney Grupları. Tüm deneyler yetişkin C57BL / 6J farelerinde gerçekleştirildi.

Deney Grupları	AAV9 iletiminin yeri/seviyesi (*)	AAV9 inj hacmi, infüzyon hızı	Hayatta kalma süresi	Doku analizi
Grup A (n = 7)	C2 (iki taraflı)	5 μL/5 dk	14 gün	Beyin + omurilik
Grup B (n = 12)	L1-L2 (iki taraflı)	1.5 μL veya 3μL, 60 sn/μL	14 gün	Beyin + omurilik
Grup C (n = 6)	C2 + L1-L2 (her seviyede ikili)	5 μL/5 dk	14 gün	Spinal kord
* - bilateral = biri enjekte edilen segment(ler)in sağ ve diğeri sol subpial boşluğuna verilen iki subpial enjeksiyon gerçekleştirilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Yetişkin Bir Farede Spinal Subpial Enjeksiyonları Gerçekleştirmek İçin Deneysel Kurulum. (A) Yetişkin farelerde spinal subpial enjeksiyonları gerçekleştirmek için iki ayrı XYZ manipülatörü kullanılır...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL/6J Fareler	Jackson Labs	664
Fareler için Laboratuvar Standardı Stereotaksik	Harvard Aparatı	72-9568
Fare Omurga Adaptörü	Harvard Aparatı	72-4811
XYZ Manipülatör	Çalma	51604
Manuel İnfüzyon Pompası	Çalma	51218
34G Eğimli Nanofill İğne Dünyası	Hassas Aletler	NF34BV-2
36G Künt Nanofill iğne	Dünyası Hassas Aletler	NF-36BL-2
Fluriso, İzofluran	MWI Veteriner Tedarik	502017
Klorheksidin Çözeltisi	MWI Veteriner Tedarik	501027
20G Paslanmaz Çelik İğne	Becton-Dickinson	305175
23G Paslanmaz Çelik İğne	Becton-Dickinson	305145
30G Paslanmaz Çelik İğne	Becton-Dickinson	305128
Pamuk Uçlu Aplikatör	MWI Veteriner Tedarik	27426
Cam Kılcal Konik	Narishige Uluslararası	SM-25B
Slayt Mikroskobu Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Mikroşırınga	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Boru	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Boru	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament sütür	VetOne	V1D397
Cam Kılcal Konik	Narishige	Pipet Mikro Öğütücü EG-40
5 dk Epoksi (Epoksi Şeffaf)	Devcon	14310
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vektör Çekirdek Laboratuvarı