In Vivo Görüntüleme için Bir Farede Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Özet

Kaynak: Pietruczyk, E. A., et al. Farede laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, in vivo görüntüleme için anestezi uygulanmış bir fareye bir omurilik penceresinin implantasyonunu göstermektedir. Protokol, bir borosilikat kapak camı ve 3D baskılı bir arka plaka kullanarak açıkta kalan omuriliği stabilize eder. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri dinamiklerini ve nörovasküler etkileşimleri incelemek için yüksek çözünürlüklü iki foton mikroskobunu mümkün kılar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kapak-cam İmplantasyonu

1. : Açıkta kalan kordona yavaşça 3 mm borosilikat kaplama camı uygulayın.
2. Agarozun 39 °C'ye soğutulduğundan emin olun. Küçük bir spatula kullanarak, kapak camının kenarına ılık% 2 agaroz / aCSF (yapay beyin omurilik sıvısı) uygulayın ve kılcal hareketin yüzeyin altına çekmesine izin verin.
   Not: 39 °C'nin altındaki sıcaklıklarda agaroz jelleşmeye başlayabilir. Böyle bir durumda, bir su banyosu veya mikrodalga kullanarak yeniden ısıtın. Bazı operatörler önce bir damla agaroz uygulamayı ve kapak camını üstüne koymayı tercih eder.
3. Torasik seviye 11 vertebral omurga ve torasik seviye 13 vertebral omurgada sağlam bitişik omurların açıkta kalan kemikli eklem süreçlerine doku yapıştırıcısı uygulayın. Laminektomi bölgesinin etrafına, bitişik tendon ve enine işlemin üzerine bir halka halinde ek doku yapıştırıcısı uygulayın.
   Not: Sonraki adımlarda diş çimentosuna düzgün yapışma için doku yapıştırıcısı gereklidir. Eklem işlemleri, arka plakanın sabit bir şekilde dayanabileceği doğal bir yuva oluşturur (Şekil 1). Eklem işlemlerine yapışma, en güçlü bağlantı noktalarını oluşturacaktır.
4. Diş çimentosunu porselen bir karıştırma tepsisinde hızlandırıcı ile karıştırın. Diş çimentosunu doku yapışkan tabakasına aktarmak için küçük bir spatula kullanın. Arka plakayı pencerenin üzerinde ortalanmış cerrahi alana yapıştırmak için diş çimentosu kullanın. Diş çimentosunun kürlenmesi için 10 dakika bekleyin.
   Not: Arka plakanın ön ve arka eklem süreçlerine sıkı bir şekilde yapışması, implantın temel yapısal stabilitesini sağlar.
5. Arka plakanın iç tabanını ve arka plakanın alt tarafını doldurmak için ek diş çimentosu kullanın: doku arayüzü.
   Not: Ekstra diş çimentosu uygulaması, yapışmayı artırır ve mikroskop objektif daldırma sıvısının (tuzlu su) arka plakanın altından sızma riskini azaltır.
6. Çatallı arka plaka tutucuyu pencerenin üzerinde uygun konuma ilerletin. Arka plakayı vidalarla arka plaka tutucusuna sabitleyin.
   Not: Bu protokol, özel olarak işlenmiş bir arka plaka tutucu kullanmıştır (Şekil 2G\u2012H).
7. Sızıntı olup olmadığını test etmek için arka plakaya tuzlu su sürün. Herhangi bir sıvı sızarsa, alanı kurulayın ve daha fazla diş çimentosu uygulayın.

2. Görüntüleme Hazırlığı

1. Hayvanı cerrahi platforma optik masaya aktarın.
   Not: Cerrahi platformumuz, arka plaka tutucumuz ve izofluran burun konisi tutucumuz, sürekli izofluran anestezisi uygulanırken cerrahi ve iki fotonlu görüntüleme istasyonları arasında tek bir ünite olarak taşınabilir (Şekil 2D, H). Benzer üniteler, ticari kaynaklardan (örneğin, ThorLabs) elde edilebilen tutma çatallarından, kirişlerden ve destekleyici direk direklerinden monte edilebilir. İntravital mikroskopi için, cerrahi platformun yüksekliğini karşılamak için mikroskop objektifi ile optik masa arasında en az 11 inç boşluk olmalıdır.
2. Cerrahi platformu, paslanmaz çelik bir montaj direği ve havşa delikli sıkıştırma çatalı kullanarak optik masaya sabitleyin.
3. Arka plakanın kuyusuna taze tuzlu su sürün. Suya daldırma merceğini kuyuya indirin.
4. İlgi alanını ve odağı belirlemek için iletilen veya epifloresan ışığı kullanın. Lazer tarama moduna geçin ve dokuda bulunan floroforlar için uygun iki fotonlu lazer uyarma dalga boyu, dikroik ve bant geçiren filtrelere göre in vivo görüntüleme gerçekleştirin6.

Sonuçlar

Şekil 1. Omurilik penceresinin anatomik yerleşiminin şematik tasviri. A) Alt torasik vertebral gövdenin, spinöz sürecin ve omurilik (sc) segmentinin üstün görünümünün şematik tasviri. Noktalı bir daire, arka plaka yapışması ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3D baskılı oval arka plaka	özel		Stabilize edici görüntüleme alanı
Cerrahi diseksiyon mikroskobu	Leica	M205 C	Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M serisi objektif ve kayma aşaması
ile donatılmıştırMikroskop kamerası	Leica	MC170	Cerrahi alanı görselleştirmek için HD renkli kamera
Kayma aşaması	Leica	10446301	Kayma aşaması iki metal plakadan yapılmıştır. Taban plakası sabittir. Üst plaka, dönme ve doğrusal harekete izin vermek için yağlanmış arayüz üzerinde kayar.
Cerrahi istasyon ve stabilizasyon çatalı	Balina İmalatı	özel	Laminektomi
SomnoSuite düşük akışlı izofluran dağıtım ünitesi	Kent Scientific	SS-01	Entegre dijital buharlaştırıcı ile cerrahi anestezi uygulaması
Paslanmaz çelik 1,5 inç montaj direği	ThorLabs	P50/M	İki fotonlu görüntüleme
için cerrahi istasyonu optik masaya monte etmek için1.5" montaj için Havşa Delme Çatalı Post	ThorLabs	PF175	İki fotonlu görüntüleme için optik masaya cerrahi istasyon montajını stabilize etmek için
İdeal kemik mikromatkabı	Harvard cihazı	72-6065	Laminektomi için inceltme kemiği
Su banyosu	Fisher Scientific	15-462-10	Isınma tuzlu
su Koter tabancası	FST	18010-00	Küçük kanamaları koordine etmek
Isıtma yastığı	Benchmark	BF11222	1.9" x 4.5" silikon ısıtıcı, 20" Teflon uçlu, 10W, 5V
K tipi termokupluplu rektal prob	Physitemp	RET3	Fare vücut sıcaklığının ölçülmesi
Vazelin	Sigma	8009-03-08	Yağlama rektal prob
Geri besleme ayarlı termal kontrolör	özel	NA	Ticari olarak temin edilebilen alternatifler arasında Physitemp TCAT serisi
PVA Cerrahi göz mızrakları	Beaver-visitec international	40400-8	Emici kan
düzeltici	Wahl	41590-0438	Kırpma fare kürkü
Bıçak, # 11	FST	14002-14	Cerrahi alet
Forseps, # 5	FST	11254-20	Cerrahi alet
Forseps, # 4	FST	14002-14	Cerrahi alet
Titatnium dişli forseps	WPI	555047FT	Cerrahi alet
Titanyum İris makas	WPI	555562S	Cerrahi alet
Vetbond doku yapıştırıcısı	3M	084-1469SB	Dental akrilik için doku yüzeyinin hazırlanması
Seramik karıştırma tepsisi	Jack Richeson	420716	Dental akrilik ajanın karıştırılması hızlandırıcı
ile Orthojet dental akrilik	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Arka plakayı dokuya kalıcı olarak yapıştırma
Küçük yuvarlak kapak camı, # 1 kalınlık, 3 mm	Harvard aparatı	64-0720	optik pencere
aCSF için NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	aCSF
için KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	aCSF
Glikoz	Fisher Scientific	50-99-7	aCSF
için HEPES	Sigma	7365-45-9	aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	aCSF
CaCl₂·2H₂O	için Fisher Scientific	#################	aCSF
Carprofen	Rimadyl	QM01AE91	Analjezi
Bakteriyostatik su	Henry Schein	2587428	Carprofen
Isofluran	Henry Schein	11695-6776-2	Anestezi
Emzirilmiş zil çözeltisi	Baxter	0338-0117-04	Fare için hidrasyon
Agarose Yüksek EEO	Sigma	A9793	jel noktası 34-37 derece C
Oftalmik kayganlaştırıcı merhem	Akwa Gözyaşları	68788-0697	Kornea kurumasını önleyin
MOM İki Fotonlu Mikroskop	Sutter

Elektrikli için için için için seyreltici