Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Beyne Yeniden Programlama Faktörlerinin Enjeksiyonu
- Hayvan kurulumu, stereotaksik yerleştirme ve delmeNOT: Bu protokol, NG2 (Nöron-Glial Antijen 2) glia'nın internöronlara yeniden programlanması için Ascl1, Lmx1a ve Nurr1 (ALN) kullanımına odaklanır. Deneyimlerimize göre, benzer bir fenotipe sahip internöronlar, diğer faktör kombinasyonları kullanılarak elde edilebilir
- Stereotaksik çerçevenin M/L-D/V kolunu yerine (hayvanın üstüne) getirin ve sabitleyin.
NOT: Stereotaksik çerçeve, şırınganın Anterior/Posterior (A/P, Y ekseni), Medial/Lateral (M/L, X ekseni) boyunca ayarlanmasına izin verir, ve Dorsal/Ventral (D/V, Z ekseni) ekseni. - Cam kılcal damarın ucunu bregma'nın (farklı kafatası plakalarının buluştuğu birleşme noktası) hemen üzerine getirmek için şırıngayı stereotaksik çerçevenin farklı ekseni boyunca hareket ettirin.
- Kılcal ucun hem A/P hem de M/L düzlemlerinde tamamen düz olduğundan emin olun. Belirsiz bir bregma durumunda, lateral ve orta hat dikişlerinin ortalamasını alın.
- Kılcal damarın ucu bregmanın üzerine doğru bir şekilde yerleştirildiğinde, dijital koordinat sayacında hem M/L hem de A/P değerlerini 0.0'a sıfırlayın.
- Hayvanın kafasının tamamen düz bir konumda olduğundan emin olmak için, A/P kolu +2.0 ve -2.0 (M/L = 0.0) ve M/L kolu +2.0 ve -2.0 (A/P = 0.0) olduğunda D/V koordinat değerini ölçmek için dijital koordinat sayacını kullanın. Diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini buna göre ayarlayın.
- Şırıngayı, striatumdaki viral vektörlerin enjeksiyonu için istenen koordinatlara getirin (A / P = +1.0; M/L = -2.0, bregmaya göre).
- Şırıngayı hafifçe kaldırın ve enjeksiyon bölgesine mikroskoptan bakarak, enjeksiyon koordinatlarında bir diş matkabı kullanarak bir delik açın. Dairesel ve nazik bir şekilde çalışarak sahada delmeye başlayın.
NOT: Matkap ucunun ek kuvvet olmadan kemikten geçecek kadar keskin olması gerektiğinden, aşağı doğru çok fazla basınç uygulamayın. Isı oluşturduğu için uzun, sürekli delmelerden kaçının. - Delme işleminin sonunda, dura materin sağlam kaldığını ve enjeksiyon için açıkta kaldığını kontrol edin.
- Şırınga kurulum hazırlığı
- Açık kesiğin üzerine bir parça pamuklu gazlı bez yerleştirin ve şırıngayı tuzlu su çözeltisiyle yıkayın.
- Yıkamadan sonra, 1-2 μL'lik bir hava kabarcığı alın, ardından viral vektörleri içeren 1 μL çözelti alın ve kasıtsız kabarcıklardan kaçının. Viral çözeltinin enjekte edilirken hava kabarcığının altında kolayca görüntülenebildiğinden emin olun.
- Viral injection
- Pamuklu gazlı bezi insizyon bölgesinden çıkarın ve stereotaksik çerçevenin D / V kolunu kullanarak şırıngayı indirin. Kafatasının yüzeyine yaklaşıldığında, mikroskoptan dikkatlice bakın ve dura mater'in D / V seviyesini ölçün - hafif basınç altında hafifçe şişmelidir.
- Kılcal damarın ucuyla dura mater'e dokunurken D/V koordinatını 0.0'a ayarlayın.
- İstenilen derinliğe yavaşça ilerleyerek şırıngayı indirin (D / V = -2.7, dura mater'e göre). İğne/kılcal damarda herhangi bir bükülme gözlenmemesi için yörüngenin kemik parçalarından arınmış olduğundan emin olun.
NOT: Sunulan koordinatlar, NG2-Cre farelerinin striatumuna yeniden programlama faktörlerinin enjeksiyonunu ifade eder. Beynin diğer bölgelerine karşılık gelen koordinatlar kullanılabilir. Yeni bir fare suşunun beynine yeniden programlama faktörlerinin enjeksiyonundan önce her zaman bir boya (örneğin, Tripan Mavisi), renkli boncuk enjeksiyonu veya bir raportör viral vektör kullanarak enjeksiyon koordinatlarını test edin. Tripan Blue enjekte ediliyorsa, hayvanların ameliyattan hemen sonra kurban edilmesi ve beynin çıkarılması gerekir. Taze beyinler bir mikrotom kullanılarak kesilebilir, dondurulurken ve beyindeki boya pozisyonunun görselleştirilmesiyle enjeksiyon bölgesi belirlenebilir. Renkli boncuklar kullanılarak koordinatlar test edilirse, enjeksiyondan bir hafta sonra perfüze edilmiş ve kesilmiş beyinlerde enjeksiyon bölgesini belirlemek mümkündür. Alternatif olarak, bir raportör gen taşıyan bir viral vektör ile bir enjeksiyon kullanılabilir ve perfüze kesilmiş beyinlerde enjeksiyon yeri belirlenebilir. - 1 μL viral çözeltiyi 0.4 μL / dak oranında enjekte edin. Tüm hacim enjekte edildiğinde, şırınga çekilmeden önce 2 dakikalık bir difüzyon periyoduna izin verin.
- Difüzyondan sonra, kılcal damarın ucu tamamen beyinden çıkana kadar şırıngayı yavaşça geri çekin.
- Yaranın üzerine bir parça pamuklu gazlı bez yerleştirin ve şırıngayı tuzlu su çözeltisiyle yıkayın.
- Stereotaksik çerçevenin M/LD/V kolunu çalışma alanından çıkarın.
- Yara kapatma ve ameliyat sonrası prosedürler
- Dikiş ipliği kullanarak kesiyi dikkatlice dikin.
NOT: Enjekte edilen hayvanlarda kullanılan tüm dikiş iplikleri, antiviral deterjan solüsyonu içeren bir kap/flakon içinde atılmalıdır. Aynı solüsyon, ameliyat bölgesini çevreleyen ve cerrahi malzemelerle temas etmiş tüm yüzeyleri temizlemek için kullanılır. Tüm cerrahi aletler her ameliyat gününün sonunda iyice yıkanır ve otoklavlanır. - Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve temiz, ısıtmalı bir kafes, yiyecek ve suya erişim ve hayvanın tamamen uyanana kadar kaldığı bir ameliyat sonrası istasyona yerleştirin. Bu süre zarfında, bilinç yeniden kazanılana kadar hayvanı yakından izleyin.
- Ameliyat edilen hayvanları, ameliyat edilmeyen hayvanlarla, birincisi ameliyattan tamamen iyileşene kadar barındırmayın.
- Ameliyat edilen hayvanları günlük olarak denetleyin. Kullanılan dikişlere bağlı olarak, gerekirse çıkarıldıklarından emin olun. Tüm hayvanlara ameliyat sonrası bakım olarak deri altından Bupenorphinum (1 ml / kg'da Temjesik) verildi.
NOT: Aynı şırıngayı art arda iki gün kullanarak çalıştırıyorsanız, suyla yıkayın, ardından %70 etanol ve tekrar su ile yıkayın. Olası kalıntıların çözünmesini sağlamak için şırıngayı gece boyunca suyla dolu bırakın.