$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Cerrahi/Kraniyotomi
- : Anestezi uygulanmış bir farenin kafasını stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. 30 G'lik bir iğne kullanarak, planlanan insizyon bölgesinde deri altına lokal analjezik ropivakain (5 μL, 7.5 mg / mL, bkz. Malzeme Tablosu) enjekte edin. Etkili olması için 5 dakika bekleyin.
- Bir neşter ile kafatasının üzerindeki deride düz bir kesim orta hattı yapın. Cildi ince forseps ile nazikçe yanlara doğru çekin ve daha fazla çalışma için kafatasını açıkta bırakmak için bulldog serrefine kelepçelerle bir kenara sıkıştırın.
- Fasya kafatasını bir neşter veya benzeri bir aletle temizleyin. Yüzeysel kanama durumunda, kanı pamuklu çubuklarla veya küçük kağıt havlu parçalarıyla alın.
- Lehimli bir tel ile poli(3,4-etilendioksitiofen) polistiren sülfonat (PEDOT:PSS) kaplı topraklama vidası (boyut: #00, çap: 0.047 inç, uzunluk: 1/8 inç, Malzeme Tablosuna bakın) alın ve bir konektörle amplifikatör kafasına bağlayın.tage.
- Kafatasını istenen delik bölgesinde nemlendirin ve dura görünene kadar beyincik üzerindeki kafatası üzerinde ince, yuvarlak bir matkap ucu (0,4 mm çapında) kullanarak yüksek hızda bir delik açın. Topraklama vidasını deliğe yerleştirin ve beyinciğin tepesine ulaşana kadar hassas bir tornavidayla vidalayın.
NOT: Baş vidası, ağırlıkça %1 3-glisidiloksipropil)trimetoksisilan (GOPS) içeren bir PEDOT:PSS çözeltisi ile daldırılarak kaplandı ve ardından 140 °C'de 90 dakika pişirildi. PEDOT: PSS, biyouyumlu olduğu bilinen hacimsel kapasitansa sahip konjuge bir polimerdir. GOPS, sulu ortamda stabiliteyi artırmak için PEDOT:PSS ile karıştırılmış bir çapraz bağlayıcıdır (Şekil 1). - Stereotaksik çerçevenin yardımıyla, istenen beyin bölgesi için stereotaksik koordinatları ölçün. Örneğin, ilgilenilen bölge, fareler için beyin atlasına dayalı olarak Bregma noktasından hipokampus, anteroposterior (AP) -1.8 mm ve mediolateral (ML) 1.8 mm'dir.
NOT: Bunlar sağ hemisfer için koordinatlardır (Şekil 1). - İnce, iyi cilalanmış, şeffaf bir kemik zarı kalana kadar hızlı bir şekilde ayarlanmış güvenilir bir diş matkabı (malzeme tablosuna bakınız) kullanarak kafatasının yaklaşık 1 ila 2 mm çapındaki bir alanını hedef bölgenin üzerinde inceltin.
- Daha sonra, kemik zarının kalınlığı yeterince ince ise (<200 μm), ince forseps ile küçük bir delik açın ve kemiğin ince tabakasını nazikçe çıkarın. Dura'yı çıkarmak için özel yapım kanca uçlu bir iğne kullanın. Ödem gelişimini önlemek ve beynin kardiyak ve/veya solunum titreşimlerini en aza indirmek için kraniyotomi ve durotomi boyutunu en aza indirin.
NOT: Kraniotomi, kurumayı önlemek için bir damla tuzlu su çözeltisi ile doldurulmalı ve daha sonra deney sırasında düzenli olarak yeniden doldurulmalıdır (Şekil 1).
2. Çok Kanallı Silikon Probun Yerleştirilmesi
- Silikon probun diğer iki implantın yerleştirilmesi için geniş alan bırakması ve elektrotun, iyon pompasının ve mikropipetin kayıt ve enjeksiyon bölgelerinin mümkün olduğunca yakın olması için hafif bir AP açısında (20°) stereotaksik kollar kullanın.
NOT: Elektrotlar, şırıngalar ve iyon pompaları, implantasyon izlerinin post hoc görselleştirmesi için bir damla DiI leke çözeltisi (1,1'-dioktadesil-3,3,3',3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat [DiI]) ile kaplandı (dimetil sülfoksit içinde 0.5 mg / ml DiI). - Silikon probu manyetik bir tutucuya bağlı stereotaksik kol üzerine yerleştirin ve stereotaksik çerçevenin yanına yerleştirin. AP açısını (20°) ayarlayın ve ardından probu başlığa bağlayıntage ve topraklama vidasına.
- Yanal hareketlerden kaçınmak için mikron hassasiyetinde stereotaksik kol veya motorlu bir mikromanipülatör yardımıyla silikon probu hipokampusa yavaşça indirin (Şekil 1 ve Şekil 2).
- Kayıt yazılımını başlatın ve çok kanallı silikon probu korteksin tepesinden hedeflenen dorsoventral (DV) pozisyonuna ulaşılana kadar (kortikal yüzeyden -1.800 μm) hareket ettirirken (headstage, bağlı amplifikatör ve bir bilgisayarla) elektrik nöronal sinyallerini kaydedin. Bilgisayar ekranında penetrasyon sırasında yerel alan potansiyel sinyalini (LFP) kaydedin ve izleyin.
NOT: Penetrasyon ve hedef bölgeye ulaşmak için daha iyi görsel kontrole sahip olmak için probun inişini kayıt sırasında yavaş ve sürekli hareket edecek şekilde kontrol edin. - Kaydedilen LFP'deki hipokampal oluşumun piramidal tabakasındaki dalgalanma aktivitesini hedef bölgenin bir belirteci olarak kullanın.
NOT: Dalgalanma aktivitesi, kayıt bölgeleri arasında 100 μm'lik bir mesafeye sahip çok kanallı silikon (Si) probunun bir veya iki komşu kanalında görülebilir (Şekil 3). - Çok kanallı Si problarının yardımıyla çok kanallı amplifikatörün yazılımı (Malzeme Tablosuna bakınız) aracılığıyla korteks ve hipokampus katmanlarından gelen LFP sinyallerini aynı anda kaydedin (Şekil 3).
3. Mikroakışkan iyon pompasının (μFIP) takılması:
- Tüpleri (Malzeme Tablosuna bakınız) μFIP'in girişine bağlayın ve probu 0.05 M gama-aminobütirik asit (GABA) çözeltisi ile doldurun. Tüpleri çıkarın ve girişi parafin film sargısı ile kapatın. Elektrik kablolarını kaynak ölçüm birimine bağlayın.
- μFIP'yi stereotaksik kolun yardımıyla mediolateral (MP) bir açıyla (20°) yerleştirin. Si probu tüm süreç boyunca takılı kalır.
NOT: μFIP çok esnektir ve beyin yüzeyine ulaşana kadar düz tutmak için küçük ve temiz bir boya fırçasının desteğinden yararlanabilir. Bu adımdan sonra, μFIP eksenel hareketlerle nazikçe indirilebilir. - μFIP'yi eksenel hareketlerle yavaşça indirin ve dorsoventral (DV) koordinatına (kortikal yüzeyden -1.200 μm) ulaşana kadar yörünge sırasında bükülmesine asla izin vermeyin.
NOT: Prizin μFIP ucundan 300 μm mesafesini göz önünde bulundurarak iki cihazı (μFIP ve silikon prob) birbirine mümkün olduğunca yakın yerleştirmeye çalışın.
DİKKAT: Yerleştirme sırasında cihazlar ve konektörleri arasında herhangi bir mekanik sorundan kaçının (Şekil 1B ve Şekil 2B).
4. Nöbet İndüksiyonu için cihazların hazırlanması
- Şırınganın metal iğnesini (10 μL) değiştirin (bkz. Malzeme Tablosu). İğne tutan metal parçayı çıkarın, mikropipeti yerleştirin ve sabitleyin (dış çap [OD]: 1,2 mm, iç çap [ID]: 0,75 mm, uç çapı: 20–50 μm ve sapın ± 0,5 cm sivrilmesiyle) ve ardından iğne tutma elemanını değiştirin.
- Şırıngayı ve takılı borosilikat mikropipeti 4-aminopiridin (4AP) (yapay beyin omurilik sıvısında [ACSF] 50 mM) enjeksiyonu için 20° lateromedial (LM) açıyla konumlandırın.
DİKKAT: Şırınganın metal iğnesini veya ucu 50 μm'den büyük olan bir mikropipeti kullanmayın. - Otomatik bir mikroenjeksiyon pompası yardımıyla 500 nL–1 μL 50 mM 4AP çekin.
5. 4AP Enjeksiyonu için Şırıngaya Bağlı Cam Pipetin Yerleştirilmesi
- Şırıngaya bağlı cam mikropipeti hedeflenen DV konumuna (-1.500 μm) indirin ve ardından 250 nL 4AP solüsyonu enjekte edin (Şekil 1 ve Şekil 2). Kayıt yazılımı ile kayda başlayın. Ekranı izleyin ve ilk interiktal artışın görünmesini bekleyin.
- İlk interiktal başak oluşumunun ortaya çıkmasıyla hemen μFIP ile GABA dağıtımını başlatın. Kaynak ile hedef arasında 1 V 100 V uygulayarak ve ardından 1 döngü boyunca 30 s kapalı uygulayarak GABA verin. Kayıt yazılımının yardımıyla en az 2 h.
kayıt yapın. NOT: Verilen GABA'nın toplam kütlesi yaklaşık 1 nmol'dür (Şekil 4). - Deneyin sonunda, takılan probları ve topraklama vidasını nazikçe çıkarın ve hayvanı stereotaksik ekipmandan çıkarın. Hayvanlara aşırı dozda ilaç (i.p.100mg / kg pentobarbital) kullanılarak ötenazi yapıldı. Ölüm, nefes ve dolaşımın durması ile doğrulandı.
