Fare beyninde hedeflenen nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyon

Özet

Kaynak: Fricano-Kugler, C. J., et al. Stereotaksik enjeksiyon yoluyla yüksek titreli CRISPR retro ve Lentivirüslerin tasarımı, paketlenmesi ve teslimi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, fare beyninde hassas nöronal gen düzenlemesi için stereotaksik viral enjeksiyonu göstermektedir. Protokol, dentat girusa doğru virüs iletimini sağlayarak, nöral devreleri, gen fonksiyonunu ve hastalık mekanizmalarını in vivo olarak incelemek için floresan etiketleme ve CRISPR aracılı gen nakavtını mümkün kılar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Stereotaksik Enjeksiyon

:

1. Uygun hava akışını sağlamak için ameliyat odasına giden ventilasyonun açık olduğunu onaylayın. Fareyi bir indüksiyon odasında% 4 izofluran ile uyuşturarak ameliyata hazırlayın. Anesteziyi takiben, enjeksiyon bölgesini hazırlamak için kafayı tıraş edin.
   1. Dili aşağı ve yana doğru hareket ettirmek için cımbız kullanarak fareyi stereotaksik alete yerleştirin. Dişler yuvaya düşene kadar ısırma çubuğunu ağzınıza sokun, ardından kulak çubuklarını sabitleyin. Farenin gövdesinin ısıtma yastığının üzerinde olduğundan ve burnun burun konisine yerleştirildiğinden emin olun. Burun konisine doğrudan% 4 izofluran. Ayağı cımbızla sıkıştırarak ve irkilme refleksi olmadığından emin olarak anesteziyi onaylayın.
   2. Gözleri yağlamak için suni gözyaşı uygulayın. Tıraşlı kafayı alternatif povidon-iyot ve lidokain turları ile temizleyerek enjeksiyon bölgesini hazırlamayı bitirin.
2. Bir neşter kullanarak, kafa derisinin merkezi boyunca küçük bir kesi kesin. Bregmayı görselleştirmeye yardımcı olmak için kafatasını bir çubukla ve gerekirse hidrojen peroksit ile kurulayın.
   1. Bir diseksiyon dürbünü kullanarak, kafatasındaki bregmayı bulun ve matkap ucunu bregmanın üzerine yerleştirin. x, y ve z düzlemlerindeki dijital stereotaktik koordinatları sıfırlayın (veya kaydedin).
   2. Kafanın rostral üzerinde kaudal y eksenine düz olduğundan emin olmak için, matkap ucunu lambda üzerine yerleştirin ve kafayı, z koordinatı hem bregma hem de lambda'da kabaca eşit olacak şekilde düzleştirin.
   3. Kafanın x ekseninde düz olduğundan emin olmak için matkap ucunu y = 1/2 lambda konumuna getirin. Z koordinatının sagital sütürün her iki tarafında (x = +/-1 mm) 1 mm'ye eşit olduğundan emin olun. Lambdanın solunda ve sağında 1 mm'de z koordinatında bir fark varsa kafatasını ayarlayın.
3. Matkabı istenen koordinatların üzerine yerleştirin. Dentat girus için, bregma'dan y = -1.9 ve x = +/- 1.1 koordinatlarını kullanın. Delmeden önce, izofluranı% 2'ye düşürün, ardından kafatasını yavaşça ve dikkatlice delin.
   1. Tüm delikleri açtıktan sonra, doldurulmuş şırıngayı stereotaksik alete yapıştırın. Şırıngayı görsel olarak deliğin üzerinde ortalayın ve kafatasındaki z koordinatını sıfırlayın.
   2. Şırıngayı yavaşça en derin z derinliğine indirin. Dentat girus için z derinlikleri -2.5, -2.4 ve -2.3'tür. Stereotaksik enjektör kullanarak 0,25 μl/dk hızında enjeksiyona başlayın.
      1. En düşük Z derinliğinde enjeksiyon tamamlandıktan sonra 1 dakika bekleyin, ardından bir sonraki koordinata yükseltin ve tekrar enjeksiyona başlayın. Tüm z-enjeksiyon koordinatları enjekte edilene kadar bu desene devam edin. Son enjeksiyondan sonra şırıngayı çıkarmadan önce 2 dakika bekleyin.
         NOT: Fare beyninde yarım küre başına 2 μl'ye kadar virüs enjekte edilerek doku üzerinde herhangi bir yan etki kaydedilmemiştir.
   3. Diğer sondaj delikleri için enjeksiyonu tekrarlayın.
4. Enjeksiyondan sonra, fareyi stereotaksik aletten çıkarın ve kafa derisini 6-0 ipek dikişlerle dikin. Yaraya Lidokain ve antibakteriyel bir krem uygulayın.
   1. Ağrıyı yönetmek için intraperitoneal (IP) yolla 0.8-1.0 ml salin + Ketoprofen (3-5 mg / kg) enjekte edin. Ardından, fareyi ısıtılmış kurtarma odasına yerleştirin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Hayvanı tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Stereotaksik Cerrahi Reaktifleri
Vet-Şırınga veteriner kullanımı TB Şırınga sadece 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
İzofluran
Paslanmaz Çelik Neşter Bıçakları, #10, 100 pk	Med-Vet International	JOR580S
Yapay gözyaşı merhemi	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Normal tuzlu	su Med-Vet International	DYND500MLSH
Pamuk uçlu aplikatörler	Med-Vet International	CTA6
Üçlü antibiyotikli merhem	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® İğneler Yumuşak Paket 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 ipek sütürler	Med-Vet International	MV-711