Bir tavuk embriyosunda nöral ve vasküler ağların görselleştirilmesi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Delalande, J., et.al. Civciv^GFP nöral tüp greftleme ve karbosiyanin boya DiI enjeksiyonu kullanılarak tavuk embriyolarındaki nöral krest hücrelerinin ve kan damarlarının ikili olarak etiketlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, GFP etiketli bir donör nöral tüpün, aşama uyumlu bir transgenik tavuk embriyosundan bir ila yedi somit seviyesinde bir alıcı embriyoya naklini ve ardından lipofilik bir floresan boya kullanılarak vasküler etiketlemeyi göstermektedir. Kombine yaklaşım, embriyonun bir stereofloresan mikroskobu altında doğrudan görüntülenmesine izin vererek, ovo'da nöral greft entegrasyonu ve vasküler ağ gelişiminin incelenmesini sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Dokuyu Greftleyin

Bir cam mikro pipet kullanarak, disseke edilmiş nöral tüpü saat camından konakçı embriyoya dikkatlice aktarın. Nöral tüpü doğru ön-arka oryantasyonda konumlandırın ve mikro neşteri kullanarak civciv konağının eksize edilen bölgesine bitişik eksplantı nazikçe itin. Nöral tüpün yönünü belirlemek için sırt yüzeyine bağlı küçük bir ektoderm parçası bırakın veya küçük bir çentik keserek bırakın.
1. Gerekirse, eksplantı, eksize edilen bölgenin tam boyutuna göre kesmek için mikro neşteri kullanın.
Nöral tüpü nazikçe ablasyonlu bölgeye yönlendirin ve sırt tarafı doğru yönlendirilecek şekilde konumlandırın. PBS'yi ve/veya grefti çevreleyen sıvıyı çıkarmak için ağız tüpüne monte edilmiş bir cam mikro pipet kullanın. Bu, donör ve konakçı dokuların yapışmasına ve greftin yerleşmesine yardımcı olur.
Dehidrasyonu ve kontaminasyonu önlemek için tüm pencereyi 24 mm genişliğinde şeffaf bantla kapatın.
Kimerik embriyoyu yumurta kabuğu üzerine bir kalemle işaretleyerek etiketleyin ve numarasını laboratuvar kitabına kaydedin. Daha fazla gelişme için yumurtayı kuluçka makinesine geri koyun.

2. DiI'yi Konakçı Embriyonun Kan Damarlarına Enjekte Edin

İstenilen deneysel zaman noktasında (burada, 3 - 10 gün sonra), kimerik embriyoyu inkübatörden alın ve yumurta içindeki embriyoya erişmek için düz makas kullanarak şeffaf bandı çıkarın.
Gerekirse, makası kullanarak kabuktaki pencereyi büyütün. Kabuğa bağlıysa koryoallantoik zara zarar vermemeye dikkat edin, bu kanamaya neden olur ve kan damarı etiketlemesini tehlikeye atar.
Yumurta sarısı üzerinde erişilebilir bir damar seçin, kan akışının embriyoya doğru yönlendirildiğinden emin olun. Vitellin damarlarından birinin dallanma noktasını seçin (Şekil 1B, C).
NOT: E6.5 - E7.5'te, yumurta sarısı damarlarına erişmek için koryoallantoik zarın cımbızla nazikçe kenara taşınması gerekebilir. E8.5'ten sonra, tek seçenek koryoallantoik membran damarlarından birine enjekte etmektir, çünkü bu aşamada koryoallantoik membran embriyoyu tamamen kaplar.
İki Dumont #5 cımbız kullanarak seçilen enjeksiyon noktasının üzerindeki vitellin zarını zıt yönlerde yırtarak çıkarın.
Bir Dumont #5 kullanarak çekilmiş bir cam iğneyi kırın ve CellTracker CM-DiI ile yüklemeden önce çapını damarın yaklaşık boyutuna ayarlayın. DiI stok çözeltisini DMSO'da 40 μg/μl'de yapın ve -20 °C'de saklayın. Çalışma solüsyonunu 4 μg/μl konsantrasyonda 0,3 M sükroz/PBS'de hazırlayın.
1. 0,3 M sükroz/PBS'de 5 - 10 μl arasında DiI'yi bir ağız tüpü ile emme kullanarak iğneye aspire edin. Daha yaşlı embriyolar 25 μl veya daha fazlasına ihtiyaç duyabilir. E8.5'ten itibaren, embriyolar daha büyük, daha kaslı damarlara sahiptir ve bunların DiI yüklü cam iğne ile bıçaklanmadan önce bir Dumont # 5 ile yerinde tutulması gerekebilir.
İğneyi hızlı bir şekilde damarın içine sokun ve DiI'nin pıhtı oluşturmadan kan akışına yavaşça katılmasını sağlamak için ağız tüpüyle sabit bir şekilde üfleyin. Alternatif olarak, DiI iletimi için bir basınç enjektörü kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1. İntravenöz DiI enjeksiyonu. (A) Önerilen aletler: a) CellTracker CM-DiI parafilm üzerine damla, b) cam enjeksiyon iğnesini çekti, c) ağız tüpü. (B) E4 kimerik civciv embriyosuna intravenöz DiI enjeksiyonunun şematik diy...