Fare Kortikal Nöronlarında Aksonal Dallanmanın Gerçek Zamanlı İn Vitro Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, kortikal nöronlarda gerçek zamanlı aksonal dallanmayı gözlemlemek için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanan bir canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hızlandırılmış videolar, aksonlarda lokalize ekzositoz ve hücre iskeleti yeniden düzenlemelerine neden olan bir sinyal molekülü olan netrin-1 tedavisinin etkilerini yakalar. Bu süreçler, olgun aksonal dallara dönüşen zar çıkıntılarını başlatır ve nöronal gelişim hakkında bilgi sağlar.

Protokol

1. Diferansiyel Girişim Kontrastı (DIC) Akson Dallanmasının Hızlandırılmış Mikroskobu

Not: Bu protokol DIC kullanırken, iletilen diğer ışık mikroskobu yöntemleri aynı amaçlar için kullanılabilir (örneğin: faz kontrastı).

1. 2 gün in vitro (DIV), %5 CO2 ve 37 °C ile nemli bir ortamı korumak için transfekte edilmemiş nöronları içeren cam tabanlı görüntüleme kabını önceden ısıtılmış çevre odasına yerleştirin. En iyi görüntü kalitesi ve çözünürlüğü için 60X Plan-Apochromat, 1.4 sayısal açıklık (NA) DIC objektif lensi ve yüksek NA kondansatör ile donatılmış bir mikroskop kullanın.
2. İletilen ışık aydınlatmasını kullanarak oküler aracılığıyla nöronları bulmak için odak düzlemini ayarlayın.
3. Görüntüleme yazılımındaki çok alanlı toplama işlevini kullanarak, en az 6 hücrenin XYZ konumlarını bulun ve kaydedin. Sahneyi, ilgilenilen nöronlar en iyi sonuçlar için görüş alanına sığacak şekilde konumlandırın.
   1. 250 ng/ml netrin-1 ile uyarın ve 'çok alanlı edinimi başlat'a basın. 24 saat boyunca her 20 saniyede bir her pozisyonda sırayla görüntü alın, alımı duraklatın ve gerektiğinde yeniden odaklayın.
4. Apps>Review Çok Boyutlu Verileri > Aç dosya adını kullanarak görüntüleme yazılımındaki görüntüleri inceleyin. Görüntüleme seansı sırasında oluşan stabil akson dallarını (20 μm uzunluğunda) tanımlayın. 20 μm uzunluk kalifikasyonunun karşılandığından emin olmak için aksonun tabanından uca kadar kararlı bir akson dalını ölçmek için çizgi çekme aracını kullanın.
   1. Bir elektronik tabloda, dalların daha sonra oluştuğu alanlarda zar çıkıntıları başladığında netrin stimülasyonundan sonraki çerçeve numarasını ve yeni ortaya çıkan dalların uzunluğu 20 μm'ye ulaştığında netrin stimülasyonundan sonraki çerçeve numarasını kaydedin.
   2. Dal başına oluşum süresini hesaplamak için çıkıntı ve dal oluşumu arasındaki kare sayısını 20 saniye ile çarpın.

Malzemeler