Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. CX3CR1-GFP fareleri kullanılarak mikroglia'nın in vivo, kronik iki fotonlu görüntülenmesi

1. Anestezi indüksiyonundan sonra, kalıntıları gidermek için metal tüpün içini steril tuzlu su ile yıkayın. Hipokampusun beyaz alveusunun camdan göründüğünden (Şekil 1A) ve ameliyat sonrası kanama gibi herhangi bir komplikasyon olmadığından emin olun.
2. Fareyi aşağıdaki adımlarda iki fotonlu mikroskobun altına ayarlayın:
   1. Fareyi iki fotonlu mikroskobun objektif merceğinin altındaki baş tutma cihazına ve motorlu XY tarama aşamasına yerleştirin. Termal destek için bir ısıtma yastığı kullanın. Anestezi derinliğini izleyin ve ayarlayın, çünkü bu kalite kontrolü 30 dakika kadar sürebilir. not: 3 mm'den daha uzun çalışma mesafesine (WD) ve yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip suya daldırmalı objektif lensi önerilir. Objektif merceğin bir düzeltme bileziği, cam ve biyomalzemeler arasındaki kırılma indisi uyumsuzluğunu telafi ederek çözünürlüğü iyileştirebilir.
   2. Cam ile objektif lens arasındaki boşluğu suyla doldurun ve hava kabarcıklarını önlemek için özel dikkat gösterin. Gerekirse, objektifin tüm ön merceğini kaplamak için daha fazla su tutan plastik bir film kullanarak metal plakanın alanını genişletin.
   3. Beyinde ifade edilen floresan probların uyarılması için 920 nm dalga boyunda femtosaniye darbeli bir lazeri açın ve görüntü elde etme yazılımını başlatın.
   4. Motorlu tablayı ve motorlu odak sistemini kullanarak odağı CA1'e (Cornu Ammonis 1) ayarlayın. Darbeli lazer tarafından sürekli aydınlatma altında beyin parankiminden yayılan floresan ve metal tüpün kenarından yansıyan ışığın rehberliğinde hedef yapıyı konumlandırın.
   5. Motorlu odaklama sistemi ile odağı ayarlayarak cam tabana değen beyin parankiminin derinliklerini ölçün. Cam tabanın ve görüntüleme düzleminin hizalamasını değerlendirmek için farklı yatay konumlardaki derinlikleri karşılaştırın.
      1. Cam alt kısım görüntüleme düzlemine paralel olacak şekilde ayarlanana kadar baş tutma aygıtını eğerek fare kafasının açısını ayarlayın.
   6. CA1'deki hedef yapının derinliğinde en yüksek çözünürlüğü elde etmek için hedefin düzeltme bileziğini ayarlayın.
3. Hipokampusun iki foton uyarımı ile elde edilen görüntülerin kalitesini ve yoğunluğunu kontrol edin (Şekil 1B).
   NOT: Görüntü bozulması, beynin içinde doku hasarının varlığını gösterir.
4. Mikrogliaların dallanmış morfolojilerini zaten geri kazandığından emin olun (Şekil 1C).
   NOT: Mikroglia'nın görüntüleme verileri, mikroglia'nın bazal durumuna dönmesi için en az 3-4 hafta gerektiğini göstermektedir.
5. Deneyin belirli bir amacı için CA1'in herhangi bir katmanında in vivo görüntüleme gerçekleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1: Kronik fazdaki CX3CR1-GFP farelerinde mikroglianın in vivo görüntülemesi. (Bir) Kronik fazda sağ dorsal CA1 (Cornu Ammonis 1) üzerinde implante edilen pencerenin temsili görün...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A femtosaniye darbeli lazer	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	A Ti:920 nm dalga boyunda kullanılan safir lazer.
CA1 görüntüleme için	iki fotonlu bir mikroskop	Nikon	A1R MP+
İki fotonlu görüntüleme için objektif lens	Olympus	XLPLN25XSVMP	Uzun çalışma mesafesine, yüksek sayısal diyafram açıklığına ve düzeltme bileziğine sahip 25 × objektif
Alüminyum plakalar	Narishige	CP-1	Kafa sabitlemesi için alminumdan yapılmış plakalar.
Dairesel cam lameller	Matsunami Cam	3φ No.1	Paslanmaz çelik borulara bağlanmış lameller.
CX3CR1-GFP fareler	Jackson Laboratuvarı	8451	Mikroglial görüntüleme için transgenik fareler.
Silindirik paslanmaz çelik borular	MORISHITA	İmplante edilecek özel yapım	Metal borular. Dış çap 3.0 mm, iç çap 2.8 mm, yükseklik 1.7 mm.
Diş reçine çimentosu (Super-Bond C&B)	Sun Medical	204610555	Diş çimentosu.
Baş tutma cihazı	Narishige	MAG-2	Açı ayarlayıcılı farelerin baş tutma cihazı
Isıtma yastığı	Biyo Araştırma Merkezi	BWT-100A ve HB-10	Ameliyat sırasında fareye termal destek sağlayan araçlar.
Isıtma yastığı	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 ve Hot-1	Araçları, baş tutma cihazında fareye termal destek sağlar.
Ketamin (Ketalar)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	Ameliyat sırasında anestezi.
Oftalmik merhem	Sato Pharmaceutical		Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için kullanılır.
Povidon-iyot ovma solüsyonu	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	Cerrahi bölgeyi dezenfekte etmek için kullanılır.
Stereo mikroskoplar,	Leica Microsystems	S8, APO	Ameliyat için mikroskoplar.
Steril tuzlu su	Otsuka İlaç Fabrikası	3311401A2026	Ameliyat sırasında yıkama solüsyonu.
Steril su geçirmez ped	AS ONE	8-5945-01	Cerrahi platform.
Ksilazin (Selaktal %2)	Ameliyat sırasında Bayer		Anestezisi.

Mikroskop.