Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. CX3CR1-GFP fareleri kullanılarak mikroglia'nın in vivo, kronik iki fotonlu görüntülenmesi

1. Anestezi indüksiyonundan sonra, kalıntıları gidermek için metal tüpün içini steril tuzlu su ile yıkayın. Hipokampusun beyaz alveusunun camdan göründüğünden (Şekil 1A) ve ameliyat sonrası kanama gibi herhangi bir komplikasyon olmadığından emin olun.
2. Fareyi aşağıdaki adımlarda iki fotonlu mikroskobun altına ayarlayın:
   1. Fareyi iki fotonlu mikroskobun objektif merceğinin altındaki baş tutma cihazına ve motorlu XY tarama aşamasına yerleştirin. Termal destek için bir ısıtma yastığı kullanın. Anestezi derinliğini izleyin ve ayarlayın, çünkü bu kalite kontrolü 30 dakika kadar sürebilir. not: 3 mm'den daha uzun çalışma mesafesine (WD) ve yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip suya daldırmalı objektif lensi önerilir. Objektif merceğin bir düzeltme bileziği, cam ve biyomalzemeler arasındaki kırılma indisi uyumsuzluğunu telafi ederek çözünürlüğü iyileştirebilir.
   2. Cam ile objektif lens arasındaki boşluğu suyla doldurun ve hava kabarcıklarını önlemek için özel dikkat gösterin. Gerekirse, objektifin tüm ön merceğini kaplamak için daha fazla su tutan plastik bir film kullanarak metal plakanın alanını genişletin.
   3. Beyinde ifade edilen floresan probların uyarılması için 920 nm dalga boyunda femtosaniye darbeli bir lazeri açın ve görüntü elde etme yazılımını başlatın.
   4. Motorlu tablayı ve motorlu odak sistemini kullanarak odağı CA1'e (Cornu Ammonis 1) ayarlayın. Darbeli lazer tarafından sürekli aydınlatma altında beyin parankiminden yayılan floresan ve metal tüpün kenarından yansıyan ışığın rehberliğinde hedef yapıyı konumlandırın.
   5. Motorlu odaklama sistemi ile odağı ayarlayarak cam tabana değen beyin parankiminin derinliklerini ölçün. Cam tabanın ve görüntüleme düzleminin hizalamasını değerlendirmek için farklı yatay konumlardaki derinlikleri karşılaştırın.
      1. Cam alt kısım görüntüleme düzlemine paralel olacak şekilde ayarlanana kadar baş tutma aygıtını eğerek fare kafasının açısını ayarlayın.
   6. CA1'deki hedef yapının derinliğinde en yüksek çözünürlüğü elde etmek için hedefin düzeltme bileziğini ayarlayın.
3. Hipokampusun iki foton uyarımı ile elde edilen görüntülerin kalitesini ve yoğunluğunu kontrol edin (Şekil 1B).
   NOT: Görüntü bozulması, beynin içinde doku hasarının varlığını gösterir.
4. Mikrogliaların dallanmış morfolojilerini zaten geri kazandığından emin olun (Şekil 1C).
   NOT: Mikroglia'nın görüntüleme verileri, mikroglia'nın bazal durumuna dönmesi için en az 3-4 hafta gerektiğini göstermektedir.
5. Deneyin belirli bir amacı için CA1'in herhangi bir katmanında in vivo görüntüleme gerçekleştirin.

Şekil 1: Kronik fazdaki CX3CR1-GFP farelerinde mikroglianın in vivo görüntülemesi. (Bir) Kronik fazda sağ dorsal CA1 (Cornu Ammonis 1) üzerinde implante edilen pencerenin temsili görünümü. Cam tabandan, alveusun beyaz lifleri ameliyat sonrası kanama olmadan net bir şekilde gözlenir. DHC ve LV, sırasıyla kaudomiyal alanda ve rostrolateral kenarda kısmen görülebilir. Ölçek çubuğu, 1 mm. (B) POD 24'te bir CX3CR1-GFP farenin in vivo kronik CA1 görüntülemesinden temsili 3D rekonstrüksiyon (genişlik: 511 μm, yükseklik: 511 μm, derinlik: 670 μm). (C) Tamamen restore edilmiş dallanmış morfolojiye sahip (B)'den alınan tipik mikroglia görüntüleri, cerrahi yüzeyden 100, 280 ve 500 μm derinliklerde 20 μm kalınlığa sahip GFP görüntü yığınlarının MIP'leri olarak gösterilir. Ölçek çubukları, 50 μm.