Fare Sinir Uçlarında Hızlı Kalsiyum Geçişlerinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Zhilyakov, NV ve diğerleri, Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Zamansal Çözünürlüğe Sahip Fare Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Akımlarının Kaydı. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, konfokal mikroskopi kullanılarak sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesine yönelik görüntüleme tekniğini göstermektedir. Siniri uyararak ve kalsiyum bağlayıcı boyalardan gelen floresan değişikliklerini yakalayarak, sinir ucundaki dinamik kalsiyum akışını ve klerensini görselleştirerek sinaptik aktivite ve nöromüsküler sinyalleme hakkında kesin bilgiler sunar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

Fareler BALB/C'den (20-23 g, 2-3 aylık) levator auris longus'un (m. LAL) izole edilmiş sinir-kas preparatları üzerinde deneyler yapıldı.

1. Ringer ve Dosyalama solüsyonlarının hazırlanması

1. Aşağıdaki malzemeleri karıştırarak memeli kası için Ringer solüsyonunu hazırlayın: sodyum klorür, NaCl (137 mM), potasyum klorür, KCl (5 mM), kalsiyum klorür, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11.9 mM) ve glikoz (11 mM). Çözeltiyi %95 oksijen (O₂) ve% 5 karbondioksit (CO₂) ile kabarcıklandırın ve gerekirse hidroklorik asit / sodyum hidroksit (HCI / NaOH) ekleyerek pH'ını 7.2-7.4'e ayarlayın.
2. Boya yükleme çözeltisini hazırlayın.
   1. pH 7.2-7.4 aralığında olan (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) (10 mM) çözeltisi hazırlayın. 500 μg ticari boya, 500 μL'lik bir şişede gelir. 30 mM'lik bir boya konsantrasyonu elde etmek için boyayı 14 μL HEPES çözeltisi içinde çözün. İyice çalkalayın ve tamamen eriyene kadar santrifüjleyin.
   2. Ca^{2 +} indikatör çözeltisini HEPES çözeltisi ile 1 mM konsantrasyona kadar seyreltin. Dondurucuda (-20 °C) saklayın ve ışığa maruz kalmaktan kaçının.

2. Boya yükleme prosedürü

NOT: Boya yükleme işlemi, daha önce yayınlanmış protokollerden uyarlanan sinir güdüğünden yükleme protokolüne göre gerçekleştirilir.

1. LAL kasını, daha önce yayınlanan protokollerde tarif edildiği gibi bu hazırlık için diseksiyon prosedürüne göre diseksiyon yapın.
   1. Elastomer kaplı Petri kabına hafifçe gerilmiş dokuyu (başlangıç uzunluğunun en fazla %30'u) ince paslanmaz çelik pimlerle sabitleyin ve kas tamamen kaplanana kadar Ringer solüsyonunu ekleyin.
      NOT: Petri kabı, üreticinin talimatlarına göre elastomer ile önceden doldurulmuştur (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Doldurma Pipetini Hazırlayın
   1. Bir mikropipet çekicisi kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), hücre içi kayıtlar için mümkün olduğunca keskin olan ince uçlu bir mikropipet hazırlayın. İç filamentleri olmayan kılcal damarlar kullanın (dış çapı 1,5 mm ve iç çapı 0,86 veya 1,10 mm).
   2. Koniği bir aşındırıcıyla çentikledikten sonra mikropipet ucunu kırın ve ucu yaklaşık 100 μm çapında açık bırakın. İç çap >80 μm'den 12-13 μm'ye küçüldüğünde ucu ateşle parlatın. Doldurma Pipetinin bir tarafına silikon bir tüp ve diğer tarafına bir şırınga (iğnesiz) takın.
3. Stereomikroskop altında, sinir gövdesinin ayrı sinir dallarına dönüştüğü yeri bulun. Doldurulmuş Pipeti monte edilmiş tüp ve şırıngayı balmumu kullanarak Petri kabına yerleştirin. Pipet ucunu sinirin üzerinde durana kadar hareket ettirin.
4. İnce bir makasla, siniri kas lifine yakın bir yerde kesin ve yaklaşık 1 mm uzunluğunda küçük bir sinir kütüğü parçası bırakın. Sinir kütüğünü bir miktar Ringer solüsyonu ile birlikte sıkıştırmadan Doldurma Pipetinin ucuna nazikçe aspire edin. Silikon tüpü Doldurma Pipetinden çıkarın.
5. Uzun filamentli bir şırınga kullanarak bir miktar boya yükleme solüsyonu (~ 0.3 μL) çekin. Bu hacim filamentin yaklaşık 3 cm'sine tekabül etmektedir.
   NOT: Başlangıçta, 10 μL hacimli bir pipet ucundan, bir alkol lambası veya bir gaz brülörü kullanarak ateşi çekerek bir filament yapmak gerekir.
6. Yükleme solüsyonunun bulunduğu filament ucunu yavaşça Doldurma Pipetine yerleştirin. Karışımı doğrudan sinir kütüğüne bırakın. Preparasyonu oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
7. Bundan sonra, preparatı taze Ringer solüsyonu ile durulayın ve 50 mL (veya daha fazla) Ringer solüsyonu içeren bir cam beherde 25 ° C'de 2 saate kadar inkübe edin (preparat solüsyonla kaplanmalıdır). Bu süre zarfında, boya sinapslara ulaşacaktır.

3. Konfokal mikroskopi ile video çekimi

NOT: Kalsiyum geçişlerinin kaydı, lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM) ile gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Hızlı kalsiyum geçişlerini kaydetmek için, yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip sinyallerin kaydedilmesine izin veren orijinal bir protokol kullanıldı. Mikroskop, 20x suya daldırma objektifi (1.00 sayısal açıklık (NA)) ile donatıldı. 488 nm lazer çizgisi% 10 yoğunluğa düşürüldü ve emisyon floresansı 503 ila 558 nm arasında toplandı.

1. Preparasyonu silikon elastomer kaplı deney odasına monte edin ve bir dizi çelik mikro iğne ile hafifçe gerilmiş olarak sabitleyin. Preparasyonu Ringer solüsyonu ile yoğun bir şekilde durulayın.
   NOT: Organik camdan yapılmış, haznenin tabanı bir elastomer ile kaplanmış (üreticinin talimatlarına uygun olarak hazırlanmış; bkz. Malzeme Tablosu) basit bir ısmarlama perfüzyon deney odası kullanılmıştır. Haznenin bir çözelti besleme borusu vardır. Çözelti, manyetik bir tutucuya monte edilmiş bir şırınga iğnesi ile dışarı pompalanır (bkz. Malzeme Tablosu). Deneysel bir oda olarak, bir Petri kabı (preparatın inkübasyonu için kullanılanlar gibi) kullanılabilir, ancak ekli besleme ve emme tüpleri ile kullanılabilir.
2. Siniri uyarmak için kullanılacak bir emme elektrodu takın.
   NOT: Elektrodu banyonun yanına cilalayarak yerleştirin ve sabitleyin. Ucu sinir kütüğüne yaklaştırın ve elektrot içine aspire edin.
3. Hazırlık haznesini mikroskop tablasına monte edin ve giriş ve çıkış bağlantılarını hazneye yerleştirin.
4. Preparatı perfüze etmek için basit bir yerçekimi akışı tahrikli sistem kullanın. Fazla çözeltiyi çıkarmak için perfüzyon emme pompasını açın.
5. Uyarıcı aspirasyon elektrodunu bir elektrik stimülatörüne takın ve stimülasyondan sonra kas kasılmalarının meydana geldiğinden emin olun. Stimülasyon koşulları ve kayıt için bölüm 3.9-3.12'ye bakın.
6. Perfüzyon sistemini d-tubokurarin (10 μM) içeren Ringer solüsyonu ile doldurun.
   NOT: Bu solüsyon kas kasılmalarını önlemeye yardımcı olur. Postsinaptik membran üzerindeki nikotinik asetilkolin reseptörlerinin D-tubokurarin veya alfa-bungarotoksine özgü blokerleri, kas kasılmalarını tamamen veya kısmen bloke eder50. Ayrıca, kas kasılmalarını önlemek için, μ-konotoksin GIIIB gibi postsinaptik sodyum kanallarının spesifik blokerleri kullanılabilir51.
7. Perfüzyon emme pompasını açın ve preparatın d-tubokurarin içeren Ringer çözeltisi ile perfüzyonunu başlatın.
8. LSCM yazılımında görüntüleme parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın.
   1. LSCM yazılımında (LAS AF; Malzeme Tablosuna bakın), Electrophysiology.
      NOT: Bu modda, zaman noktasında bir görüntü yakalandığında, tetik kutusu yardımıyla stimülatörüne bir senkronizasyon darbesi gönderilir. Bu, preparatta aksiyon potansiyeli oluşumunu ortaya çıkarır (Şekil 1; stimülatör ünitesi).
   2. Alım Modu'nu seçin. Mikroskop senkronizasyon darbesini kullanarak stimülatörü tetiklemek için, İş menüsü ayarlarında Tetikleme ayarlarını seçin. Tetikleyici On Frame (Kare Açıkta Tetikleyici) alanını out1 kanalına ayarlayın.
   3. Aşağıdaki ayarları kullanın: Tarama Modu: XYT, Tarama Frekansı: 1400 Hz, Yakınlaştırma Faktörü: 6.1, İğne Deliği: tamamen açık. Sıralı geçiş Çift Yönlü X modunun açık olduğundan emin olun.
   Bir
   4. kare oluşturmak için minimum süreyi 52 ms'de ve ham videoda toplanacak kareleri 20 karede ayarlayın.
      NOT: Bu ayarlar, her 52 ms'de tek bir kare çekerken 128 x 128 piksel çözünürlükte görüntü yakalamaya izin verir.
   5. Argon lazerin uyarma dalga boyunu, çıkış gücünün% 8'i ile 488 nm'ye ayarlayın.

Boya yüklü sinir terminallerinin önizlemesini almaya yardımcı olan Canlı moda geçmek için Canlı Mod düğmesine basın.

9. Stimülasyon ünitesi
   NOT: Bu cihaz, MATLAB yazılımı aracılığıyla stimülasyonun zamansal parametrelerinin ayarlanmasına izin verir.
   1. Yeni bir dosya oluşturun, yukarıda belirtilen makaledeki kodu MatLab kod penceresine yapıştırın ve dosyayı kaydedin. Çalıştır'a tıklayın, böylece stimülasyon parametrelerini içeren bir pencere belirir. Uyaranın gecikme süresini ve süresini ayarlayın.
      NOT: Gecikme, yeniden oluşturulan floresan sinyalin zamansal çözünürlüğünü belirler. 0,2 ms süreli elektrik darbesi geciktirilir ve daha sonra izolasyon ünitesine gönderilir. Sonuncusu, uyarıcı darbenin genliğini ve polaritesini oluşturur ve biyolojik nesneyi kayıt ekipmanından elektriksel olarak izole eder.
   2. Siniri uyarmak için, uyarıcı impulsun supramaksimal genliğini seçin (tüm sinir liflerini aktive etmek için gerekli maksimum stimülasyon yoğunluğundan %25-%50 daha büyük).
      NOT: Sunulan yöntem, en aza indirilmiş tarama ile LSCM kullanarak tek hızlı floresan sinyallerini kaydetmek için özel bir algoritmaya dayanmaktadır. Geliştirilen algoritmanın her adımında, kaydedilen floresan sinyali, mikroskop taramasından daha kısa bir zaman aralığı ile bir öncekinden kaydırılır. Zaman kaymalarının değeri, gerekli sinyalin zamansal çözünürlüğünü belirler. Algoritmadaki adımların (kaymaların) sayısı, gerekli zamansal çözünürlüğe ve orijinal zamansal çözünürlüğe bağlıdır. Bu kayıt yöntemiyle, preparatın uyarılması 0.25 Hz'lik bir frekansla gerçekleştirilir.
10. Canlı modda, yatırım getirisini arayın ve en iyi odağı elde edin. Veri toplama yazılımını çalıştırın.
11. Stimülatör üzerindeki gecikmeyi önceki değere göre 2 ms daha az kaydırın ve veri toplama yazılımını çalıştırın.
Her dizi bir öncekinden
12. 2 ms kaydırılacak şekilde 26 dizi elde etmek için adım 3.11'i 26 kez tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Deney düzeneğinin şeması. 1. Lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM). 2. LSCM'nin senkronizasyon modülü (tetik kutusu). 3. Stimülatörü. 4. İzolasyon ünitesi. 5. Biyolojik örnek. 6. Sinirin elektriksel stimülasyonu için emme elektrodu. 7. Perfüzy...

Malzemeler