Demiyelinize Fare Modelinde Ozmotik Pompa Bazlı Nöroterapötik İlaç Dağıtımı

Özet

Kaynak: Wang, X. et. al., Merkezi Sinir Sistemi Üzerine In Vivo Remiyelinasyon Araştırması için Ozmotik Pompa Tabanlı İlaç Dağıtımı. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, demiyelinize bir fare modelinde ozmotik bir pompa kullanarak nöroterapötik ilaçların verilme yöntemini göstermektedir. Kontrollü ilaç salınımı, korpus kallozumdaki miyelin üreten hücreleri aktive ederek remiyelinizasyonu teşvik eder.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Lisolasitin ile indüklenen demiyelinizasyon fare modelinin kurulması

1. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile% 1 lizolesitin (L-α-Lizofosfatidilkolin olarak da adlandırılır) çözeltisi hazırlayın.
2. Makasları, forsepsleri, kavisli kanama durdurucuları ve diğer cerrahi aletleri otoklav sterilizasyonu ile sterilize edin. Cerrahi alanı sterilize edin ve steril çarşaflar serin. Ameliyat için kullanılan tüm materyaller ve reaktifler aseptik olarak hazırlanmalıdır. İşlem boyunca cerrahi bölgenin steril tutulması önemlidir.
3. Doğum sonrası bir gün 56 (P56) C57BL6 fareyi aşağıdaki gibi uyuşturun.
   1. Fareyi küçük hayvan anestezi makinesinin izofluran odasına yerleştirin. _O2 akışını 300-500 mL / dk'ya ve izofluranı% 3 -% 4'e ayarlayın. Yeterli anesteziden sonra, fare yavaş ve stabil bir nefesle hareketsiz hale geldiğinde, fareyi bir ısıtma yastığı ile stereotaksik cihaza aktarın.
   2. Gaz çıkışını hazneden anestezi maskesine geçirin ve fareyi anestezi durumunda tutmak için izofluranı% 1 -% 1.5'e ayarlayın. Fare tamamen uyuşturulana kadar bekleyin, ardından ağrıyı hafifletmek için intraperitoneal olarak ketoprofen (3-5 mg/kg) enjekte edin. Ameliyattan önce, farenin ayak parmaklarını sıkıştırın ve başarılı anesteziyi doğrulamak için reaksiyonunu kontrol edin.
   3. Fare uyuşturulduğunda vücut ısısını düzenleyemez. Bu nedenle, ameliyat sırasında farenin vücut ısısını izleyin ve düzenleyin. Anestezi altındayken gözbebeklerini nemli tutmak için farenin gözbebeklerinin yüzeyini eritromisin göz merhemi ile kaplayın.
4. Fare kafasını diş çubuğu ve kulak çubukları ile stereotaksik cihaza sabitleyin. (Şekil 1A).
5. Başın üst kısmındaki tüyleri almak için bir tıraş bıçağı kullanın. Kafa derisini üç döngü betadin ve% 75 etanol ile sterilize edin. Etik kaygılar için, ameliyat bölgesi dışında hayvan vücudunu örtün. Bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için boynun tabanından gözlerin arasına kadar ciltte 1 cm uzunluğunda orta sagital bir kesi yapın (Şekil 1B).
6. Kraniyal sütürleri görselleştirmek için kafatasının yüzeyini %30 hidrojen peroksit içeren steril bir pamuklu çubukla nazikçe silin (Şekil 1C). Diş çubuğunun ve kulak çubuklarının yüksekliğini, lambda noktasını ve bregma noktasını aynı yüksekliğe (yani, iğne ucu noktalara temas ettiğinde aynı z ekseni koordinatlarıyla) yerleştirmek için ayarlayın, böylece sagital sütür yatay olur.
7. Mikrolitre şırınga iğnesinin ucunu (10 μL, 33 G) nazikçe bregma noktasına yerleştirin ve x, y ve z koordinatlarını 0'a sıfırlayın (Şekil 1D). Şırıngayı dijital okuma istemine göre enjeksiyon bölgesine (x: 1.04; y: 1.0, yani orta hatta 1.04 mm lateral ve bregma noktasına 1.0 mm arka) hareket ettirin (Şekil 1E).
8. 1 mL şırınga iğnesi (26 G, 0.45 mm) ile duraya nüfuz etmeden enjeksiyon bölgesinde kafatasından yavaşça küçük bir çapak deliği açın (Şekil 1F). Mikrolitre şırınga iğnesini, belirli bir derinliğe ulaşılana kadar (çoğu P56 faresi için z = -1.62 mm) delikten beyin dokusuna yavaşça sokun. (Şekil 1G).
   NOT: Ampirik olarak, -1.62 mm'lik yerleştirme derinliği, iğne ucunun çoğu P56 faresinin korpus kallozumunun ortasına ulaşmasına izin verir, böylece lizolesitin, demiyelinizasyonu indüklemek için doğrudan korpus kallozuma verilebilir.
9. 0,3 μL/dk hızında 1,5 μL %1 lizolesitin enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, enjeksiyon iğnesi yolu boyunca sıvı sızıntısını önlemek için mikrolitre şırıngayı yavaşça dışarı çekmeden önce 5 dakika bekleyin.
10. Cildi 5-0 cerrahi dikişlerle dikin (Şekil 1H).
11. Vücut ısısında bir düşüşü önlemek için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Ağrıyı hafifletmek için her 24 saatte bir 5 mg / kg carprofen deri altı enjeksiyonu uygulayın. Yaranın düzgün bir şekilde iyileşmesini sağlamak için her gün insizyona eritromisin merhem sürün. Ameliyat geçiren fareyi tek başına bir kafese koyun ve tamamen iyileşene kadar nemli yiyeceklerle besleyin. İşlemden sonra fareyi günlük olarak izleyin.

2. Ozmotik pompanın hazırlanması

NOT: Pompanın ana bileşenleri Şekil 2A'da gösterilmiştir.

1. Beyin infüzyon kanülünün beyne yerleştirilme derinliğini belirleyin. Kullanılan beyin infüzyon kanülünün iğnesinin 3 mm uzunluğunda olduğundan ve her bir derinlik ayar ara parçasının 0,5 mm olduğundan emin olun. 1,5 mm'lik bir enjeksiyon derinliği elde etmek için (kallozuma yakın), beyin infüzyon kanülünün iğnesine doku yapıştırıcısı ile üç derinlik ayar ara parçası takın (Şekil 2B, C).
2. Ozmotik pompayı doldurmak için, pompa paketiyle birlikte gelen şırınga iğnesini 1 mL'lik bir şırıngaya takın ve ilacı aspire edin. Pompayı dik tutun, şırıngayı pompanın üst kısmındaki açıklığa yerleştirin ve kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek ilacı yavaşça enjekte edin (bkz. Şekil 2D). Sıvı açıklıktan dışarı aktığında, şırıngayı yavaşça dışarı çekin.
3. Akış moderatörünü bükmemeye veya ezmemeye dikkat ederek beyaz flanşı makas veya pense ile akış regülatöründen çıkarın. Ardından akış moderatörünü pompaya yerleştirin (Şekil 2E). Ozmotik pompada kabarcık olup olmadığını belirlemek için, ozmotik pompayı doldurmadan önce ve sonra ayrı ayrı tartın.
4. Kateteri hayvanın boyutuna göre belirli bir uzunlukta kesin (yaklaşık 25 g ağırlığındaki P56 fareler için 20-25 mm kateterler). Kateteri beyin infüzyon kanülüne takın.
5. Hava vermeden şırıngayı kullanarak kateteri ilaçlarla doldurun (Şekil 2F).
6. Kateteri akış moderatörüne bağlayın. Taktıktan sonra, kateterin açıkta kalan akış moderatörünün yaklaşık 4 mm'sini kapladığından emin olun (Şekil 2G).
7. Ozmotik pompanın implantasyondan hemen sonra çalışabilmesini sağlamak için, doldurulmuş pompaları en az 4 ila 6 saat boyunca (tercihen gece boyunca uzatın) 37 °C'de steril %0,9 tuzlu su veya PBS'ye daldırın ve pompa yüzeyindeki yarı geçirgen zarı doku ortamıyla aynı ozmotik basınca sahip solüsyonlarla önceden ıslatın (Şekil 2H).
8. Pompalara yüklenen tüm solüsyonlar steril olmalıdır. ALZET pompaları, sterilizasyon dozunda kobalt-60'a maruz bırakılmış olarak steril olarak tedarik edilir. Bununla birlikte, dış kirlenme meydana gelirse, pompanın yüzeyi izopropil alkol ile (suda% 70) silinerek temizlenebilir.

3. Ozmotik pompanın implantasyonu

1. : Korpus kallozum demiyelinizasyon modelinin kurulmasından sonra 3 gün bekleyin. Küçük hayvan anestezi sistemini açın. Makasları, cımbızları ve hemostatik penseleri dezenfekte edin ve% 75 alkol çözeltisine batırın. Cerrahi alana steril çarşaflar yerleştirin.
2. Fareleri tekrar stereotaksik cihaz üzerinde uyuşturun ve sabitleyin. Kuruluğu önlemek için göz kürelerinin yüzeyini bir göz merhemi ile örtün.
3. Orijinal yarayı% 75 alkolle dezenfekte edin. Daha önce dikilmiş olan cerrahi insizyonu açın (Şekil 3A) ve insizyonu kürek kemiklerine doğru genişletin (Şekil 3B).
4. Kürek kemiğinde hemostatik pense veya cımbız yardımıyla cildi cilt altı bağ dokusundan ayırarak boşluk açın (Şekil 3C). Ozmotik pompayı boşluğa yerleştirin (Şekil 3D, E).
5. Pamuklu çubukla, demiyelinizasyon modeli oluşturulurken oluşturulan kafatasının yüzeyindeki iğne deliğini nazikçe silin ve ortaya çıkarın (bkz. adım 1.8). Beyin infüzyon kanülünü bu iğne deliğinden dik olarak yerleştirin ve doku yapıştırıcısı ile hızlı bir şekilde kafatasına sabitleyin (Şekil 3F).
6. Beyin infüzyon kanülünün üzerindeki çıkarılabilir tırnağı bir makasla çıkarın (Şekil 3G, H). Alternatif olarak, bu işlem sırasında sallanmayı önlemek için kanülü yerleştirmeden önce tırnağı çıkarın.
7. Kesiği dikin veya doku yapıştırıcısı ile tutturun (Şekil 3I).
8. Ameliyattan sonra, vücut ısısının düşmesini önlemek için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Ağrıyı hafifletmek için her 24 saatte bir 5 mg / kg carprofen deri altı enjeksiyonu uygulayın. Yaranın düzgün bir şekilde iyileşmesini sağlamak için her gün insizyona eritromisin merhem sürün. Hayvanı tek başına bir kafese koyun ve tamamen iyileşene kadar nemli yiyeceklerle besleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Lisolesitin ile indüklenen demiyelinizasyon fare modelinin kurulması. (A) Fareyi stereotaksik cihaza sabitleyin. (B) Kafatasını ortaya çıkarmak için 1 cm'lik orta sagital bir kesi açın. (C) Krani...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anestezi hava pompası	RWD	R510-29	E05818-006
Beyin infüzyon kiti 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofen	Macklin	C830557-1g	Her 24 saatte bir 5 mg / kg
Eritromisin gözü merhem	Teknoloji boyunca	YCKJ-RJ-024780	Anestezi sırasında gözbebeklerinin yüzeyini örtün
Eritromisin merhem	pythonbio	RG180
Gaz tahliye cihazı	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lizofosfatidilkolin	Sigma	L0906	Steril PBS
Mikrolitre şırınga	Hamilton	65460-05	Şırınga serisi: 1700, 10 μL, 33 gauge
Mikro-ozmotik pompa modeli 1002	ALZET	4317	Saatte 0.25 μL, 14 gün
PBS (pH = 7.3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sodyum	Şangay Civi	CAS NO: 57-33-0	Ötenazi için 150-200 mg / kg intraperitoneal enjeksiyon
Küçük hayvan anestezi makinesi	RWD	R520IE	E05807-006 M
Stereotaksik ekipman	RWD	E06382
STERI 250 sterilizatör	Keller	31101	Cerrahi aletlerin hızlı sterilizasyonu
Cerrahi sütürler	Şangay jinhuan	F504	5-0
Şırınga iğnesi (1 mL)	Şanghay KDL	6930197811018	26 gauge (0,45 mm x 16 mm)
İlaç ve çözücü	testiDeneye bağlı	N/A Thermostar
homeotermik izleme sistemi	RWD	69026	Anestezi sırasında vücut ısısını koruyun
Vetbond doku yapıştırıcısı	3M	1469SB	Beyin infüzyon kanülünü sabitleyin ve cilt kesisini yapıştırın

ile% 1'de çözün