Bir Test Bileşiğinin Sıçan Merkezi Sinir Sistemine İntratekal Verilmesi

Özet

Kaynak: Chen, Y., et al. Sıçan merkezi sinir sisteminde antisens oligonükleotidlerin intratekal iletimi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, bir sıçan modelinin lomber omurgasına implante edilen bir kateter yoluyla beyin omurilik sıvısına (BOS) bir test bileşiğinin verilmesini göstermektedir. Bileşik, BOS boyunca beyne ve omuriliğe dolaşır, nöronlara girer ve terapötik potansiyel sunar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Ameliyat

:

1. 50 mL'lik konik tüp tarafından desteklenen sıçan ile, pelvisin üzerindeki kaslar arasındaki iki doğal çukuru tanımlayın (Şekil 1A'daki oklar). Bir elinizle bu çukurları tutarken, diğer elinizle omurgayı kaudalden rostral yöne doğru hafifçe bastırın ve hissedin ve omurlar arasındaki ilk büyük girintiyi bulun ve bu, sakral 1 (S1) ve lomber 6 (L6) omurları arasındaki intervertebral boşluktur (Şekil 1B).
2. Bir sonraki girintiyi, lomber 5 (L5) ve L6 omurları arasındaki intervertebral boşluğu ve enjeksiyon bölgesini (* Şekil 1A'da) belirlemek için hafifçe rostral olarak hareket edin. Enjeksiyon bölgesi insizyonun merkezinde olacak şekilde rostraldan kaudal'a orta hat boyunca deride 2 cm'den daha uzun olmayan bir kesi yapmak için bir neşter kullanın (Şekil 1A'da noktalı çizgi).
3. Kas tabakasını görselleştirmek için bağ dokusunu incelemek için diseksiyon makası kullanın. Ardından, L6 bel omurunun dorsal omurga sürecinin hemen yanında kas kapsülünde 1 cm'lik bir kesi yapın.
   NOT: L6 bel omurunun kemikleri bu noktada görüntülenebilir.
4. Kılavuz kanül iğnesi tertibatını 6. bel omurun ön yüzüne yakın bir yere yerleştirin ve iğnenin ucu omurilik kanalına nüfuz edecek şekilde 6. omurun ön yüzü boyunca intervertebral boşluğa itin. Kılavuz kanülü iğne boyunca yerine itin ve sadece kılavuz kanülü yerinde bırakarak 23-G iğneyi çıkarın.
   NOT: İğneyi yerleştirmeden önce L6 bel omurunun dorsal sürecini bulmak için künt forseps kullanmak faydalı olacaktır. Genel olarak, beyin omurilik sıvısı (BOS) sıvısının iğne göbeğine girdiği görülebilir (bu sıvı bir miktar kanla renklendirilebilir, ancak bu zarar verildiğini veya iğnenin doğru yerleştirilmediğini göstermez). Yazarlar bu prosedür sırasında çok miktarda kan veya şiddetli kanama görmemişlerdir. Her ikisi de meydana gelirse, uygun tedaviyi ve hayvanlara ötenazi yapılıp yapılmayacağını belirlemek için bir veterinerle iletişime geçilmelidir.
5. Kateter teli tertibatını kılavuz kanüle yerleştirin. Kateter teli düzeneğini omurilik kanalına yaklaşık 45°'lik bir açıyla aşağı doğru eğin ve ucunu omurilik kanalına yaklaşık 0,3 cm zorlayın.
6. Kılavuz kanülü çıkarın, kateteri stile teli yerinde bırakın. Stile telini kateterin intratekal ucundan yaklaşık 2,5 cm çıkarın ve Şekil 2Bvi'da gösterildiği gibi kanalın girişinde (kasın hemen altında görülebilir) 2 cm'lik işaret olana kadar kateteri omurilik kanalına ilerletin.
   NOT: Takılan kateter, subaraknoid boşluğa rostral olarak uzanmalıdır. Başarılı bir yerleştirme, kateterin o boşlukta serbestçe hareket etmesine izin vermelidir.
7. Stile telini tamamen geri çekin ve BOS implante edilen katetere girerken görülebilir.
8. Doğum kateteri düzeneğini 30 G iğne ucu aracılığıyla implante edilen kateterin distal ucuna bağlayın (Şekil 2Bv, vi).
9. 100 μL'lik bir şırıngaya (yıkama şırıngası) 60 μL steril salin yükleyin. Test bileşiğinin 30 μL'lik bir bolusunu yükleyin (ör., antisens oligonükleotid veya ASO çözeltisi) ikinci bir şırıngaya (enjeksiyon şırıngası) yerleştirin.
10. Yıkama şırıngasını (tuzlu su yüklü) dağıtım kateteri tertibatının boru adaptörü ucuna bağlayın (Şekil 2Bv). İntratekal boşluğa 20 μL steril salin enjekte edin (enjeksiyon öncesi yıkama).
11. Enjeksiyon şırıngasını (test bileşiği ile yüklü) dağıtım kateteri tertibatının boru adaptör ucuna bağlayın (Şekil 2Bv). 30 μL test bileşiğini 30 sn boyunca intratekal boşluğa enjekte edin.
    NOT: ASO'nun rutin enjeksiyon hacmi, omurilikte ve kortekste iyi bir yıkım elde etmek için 30 μL'dir. Enjeksiyon hacimlerinin bileşik dağılımını etkileyebileceği bildirilmiştir, ancak farklı enjeksiyon hacimleri test edilmemiştir. Başka bir bileşik veya hacim kullanılıyorsa, güvenlik ve etkinliğin ampirik olarak belirlenmesi gerekir.
12. Adım 1.10'u tekrarlayın ve kateteri 40 μL steril salin ile yıkayın (enjeksiyon sonrası yıkama). Daha sonra doğum kateteri tertibatını implante edilen kateterden ayırın.
    NOT: Enjeksiyon öncesi ve sonrası yıkamanın, bileşiklerin lokal sekestrasyonunu azalttığı ve rostral yapılara dağılımını iyileştirdiği düşünülmektedir.
13. İmplante edilmiş kateteri aseptik olarak kesmek ve ısıyla kapatmak için, bir çift steril diseksiyon forsepsini çok sıcak olana kadar bir boncuk sterilizatörüne yerleştirin, ardından forsepsin sıcak ucu ile boruyu sıkıştırın.
    NOT: Bu işlem kateteri eritir. Böylece, tüpteki delik çöker ve her taraf birbirine yapışarak boruyu aseptik bir şekilde kapatır. Daha sonra cilt altı boşluğa yerleştirilir.
14. Kalan ısıyla kapatılmış kateteri bağ dokusuna sabitlemek için emilebilir monofilament sütürler kullanın. Ardından, cildi güvenli ısıyla kapatılmış kateter üzerinden kapatmak için emilmeyen monofilament sütürler kullanın.
    NOT: Yara klipsleri, kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi (IACUC) protokolü tarafından onaylandığı şekilde de kullanılabilir. Teknik, tekrarlanan enjeksiyonlarla uyumludur, ancak ellerimizde sadece bir kerelik enjeksiyonlar için kullanılmıştır. Tekrarlanan enjeksiyonların fizibilitesi, IACUC'un onayı ile ampirik olarak değerlendirilmelidir.
15. Derideki kanı yıkamak için gazlı bez ve salin kullanın ve hayvanın ısıtılmış bir inkübatörde anesteziden hareket edene kadar iyileşmesine izin verin, bu noktada ev kafesine geri döndürülür (kafes başına iki sıçan).
    NOT: Aynı gün birden fazla sıçan üzerinde ameliyat yaparken, kanı çıkarmak için aletleri su kullanarak temizleyin ve ısıtılmış kuru boncuk sterilizatörü kullanarak yeniden sterilize edin (en az 20 s, soğuma zamanı ile) hayvanlar arasında. Her 5 hayvan için yeni bir alet seti kullanılır.
16. Hayvanları ameliyattan sonra en az 3 gün boyunca günlük olarak izleyin ve IACUC protokolüne göre ameliyattan sonra haftalık olarak izlemeye devam edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Enjeksiyon bölgesinin ve insizyon hattının tanımlanması. (A) Sıçanın karnı 50 mL'lik konik bir tüp ile desteklendiğinde, pelvisin üzerindeki kaslar arasındaki iki çukur kolayca görülebilir (oklar). (B) Bir elinizle çukurları tutarken, diğer elin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD intramedic PE boru	BD	Polietilen boru PE50, BD	427400 (10 ft, Fischer Scientific 22-204008) veya 427401 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
intramedic PE boru	BD	Polietilen boru PE10, çap BD	427410 (10 ft, Fischer Scientific 14-170-11B) veya 4274011 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD PrecisionGlide tek kullanımlık iğneler 30G	BD		BD
Kılavuzu kanül	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) iğne	BD 305186
Hamilton şırınga 100 ul	Hamilton şirketi	Hamilton şırınga 100 ul
Sıcak boncuk sterilizatörü	İnce Bilim Araçları		Sterilizatör model no. FST 250
Povidone ovma	PDI		S48050
Tuzlu	Baxter	Sodyum klorür% 0.9 intravenöz infüzyon BP 50 ml	FE1306G
Neşter	Tüyü	Tek kullanımlık neşter	No. 10
Küçük hayvan ısıtma yastığı	K&H İmalat		Model no. 1060
Stile tel	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Cerrahi havlu örtüsü	Dynarex		4410
Cerrahi makas ve forseps	FST ve Fisher Scientific Sütürler
	Ethicon		4-0 veya 5-0
Bu prosedür
Dozaj kateteri sistem	SAI İnfüzyon Sistemleri		RIDC-01
Kılavuz kanül	SAI İnfüzyon Sistemleri		RIDC-GCA
Dahili kateterler	SAI İnfüzyon Sistemleri		RIDC-INC
Stile teli	SAI İnfüzyon Sistemleri		RIDC-STY

BD 305128 için önceden hazırlanmış ve sterilize edilmiş malzemeler için alternatif kaynak