Bir konumlandırma cihazı kullanılarak siRNA'nın fare beynine intranazal iletimi

Özet

Kaynak: Ullah, I., et.al. Merkezi sinir sistemine intranazal siRNA iletimi sırasında farelerin yerleştirilmesi için bir konumlandırma cihazı. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, özel bir konumlandırma cihazı kullanarak fare beynine nöron hedefleyen peptit-siRNA kompleksleri iletmek için hassas bir intranazal uygulama tekniğini göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareler, akciğer drenajını önlerken siRNA inhalasyonunu optimize etmek için baş aşağı ve ileri pozisyonda sabitlenir. Hedefleme peptidi, nöronlarda reseptör aracılı alımı kolaylaştırarak, beyinde hedeflenen siRNA iletimini ve gen susturulmasını sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fare konumlandırma

1. Cerrahi düzlemi korumak için pedal refleksi (sert ayak parmağı çimdikleme) ile anestezi seviyesini değerlendirin.

2. Gerekli tüm reaktiflere kolay erişim sağlamak için konumlandırma cihazını uygun bir mesafe ve yüksekliğe yerleştirin.

3. Fareler uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, her fareyi başparmağınız ve işaret parmağınızla boynunun tırnağından nazikçe kaldırın ve belirlenen sandalyeye yerleştirin.

4. Farenin sandalyeye doğru konumlandırılması bu aşamada çok önemlidir. Farenin sırtını sandalyenin sırt desteğine paralel ve sandalye koltuğuna 90° açıyla yatırın. Ellerinizi farenin üzerinden kaldırın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi, hayvanın itmeden veya bastırmadan, baş aşağı ve ileri pozisyonda doğal olarak yatmasına izin verin. Hayvan bu rahat pozisyondayken, fareye herhangi bir rahatsızlık vermeden farenin ön ayaklarının doğal destek sağladığından emin olun.

5. Fareler düzgün bir şekilde yerleştirildikten sonra, fareleri sandalye kemeriyle bağlayın ve hemen burun içi aşılamaya başlayın.

2. İntranazal (IN) teslimat

NOT: Bu protokol, fare konumlandırma cihazı kullanılarak RVG9R:siRNA komplekslerinin IN dağıtımını açıklar. Bu protokolü kullanarak, her fareye 2 μL'lik damlalar halinde maksimum 20-30 μL çözelti kolayca uygulanabilir. Bu hacim, farenin 0.032^cm3 olan burun boşluğundan daha düşüktür, bu nedenle prosedür ölümcül burun deliği tıkanıklığı veya boğulma ile sonuçlanmaz. Bu protokol, cihaz başına en az dört farenin ve en fazla sekiz farenin aynı anda aşılanmasına izin vererek zaman optimizasyonu ve değişkenliğin azalmasına neden olur.

1. 10 μL'lik mikropipeti alın ve 2 μL'ye ayarlayın.

2. Mikropipeti 2 μL RVG9R:siRNA kompleks çözeltisi ile yükleyin (örneğin, dağıtım deneyi için 104 μg RVG9R ile komplekslenmiş 5,2 μg siCy5 ve susturma deneyi için 270 μg RVG9R ile komplekslenmiş 13,5 μg siSOD1, %5 glikoz içeren 25 μL PBS'lik bir son hacimde.

3. Pipeti baskın elinizde tutarken, dirseğinizi tezgahın üzerine koyarak konumu ayarlayın. Uygulama sırasında kontrolsüz hareketlerden kaçınmak için pipeti tutan elinizi diğer elinizle destekleyin.

4. Farenin damlacığı doğrudan soluyabilmesi için bir burun deliğine çok yakın ~2 μL'lik bir damla yerleştirin (bkz. Şekil 1B). Küçük bir damla kolayca oluşmuyorsa, pipet ucunu yenisiyle değiştirin ve işlemi tekrarlayın. Aşılar arasındaki zaman aralığını doğrulamak için kronometreyi kullanın.

5. Bu cihaz, aynı anda en az dört farenin tedavisine izin verir. Başka bir fare grubunun adım 2.4'ü tekrarlaması gerekiyorsa, cihazda aynı anda sekiz fareyi barındırmak için ilk çubuğun üstünde veya altında dört sandalyeli başka bir çubuk ayarlayın.

6. İlk aşılamadan 3-4 dakika sonra diğer burun deliği ile 2.4 adımını tekrarlayın. Bu zaman aralığı, farenin ilk dozun solunmasını tamamlaması ve normal solunumu geri kazanması için yeterlidir. Farenin narisinden yanlışlıkla burundan çekilmesi nedeniyle solunan solüsyonun bir damlası yerinden çıkarsa, 2 μL daha solüsyonu yeniden aşılayın.

7. 20-30 μL doz bitene kadar tüm işlemi alternatif burun delikleriyle tekrarlayın. Tüm aşılama prosedürünün tamamlanması ~ 30-45 dakika sürecektir.

8. Fareleri belirlenen kafeslerine geri döndürmeden önce farelerin gözlerine ıslak merhem sürün.
NOT: Fareleri, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakmayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Konumlandırma cihazı kullanılarak IN aşılama prosedürünün fotoğrafik sunumu. (A) IN aşılaması için gerekli deney ekipmanı. (B) Baş aşağı ve ileri pozisyonda hayvanlar, cihaz üzerinde oturuyor (solda) ve IN aşılaması için 2 μL'lik bir da...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mouse suşu
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8 haftalık, 20-30g
Peptitler
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
Yazılım, algoritmalar ve cihazlar
Fare konumlandırma cihazı	Signet Biotech	N/A
Oligonükleotidler ve primerler
siSOD1	ST Pharm	N/A	Anlamlı: 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
primerleri	ST Pharm	N/A	F: 5'-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3' R: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'