Epifloresan Mikroskopi Kullanılarak Genikülat Ganglion Nöron Yanıtlarının İn Vivo Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Fowler, B. E., et al. Tat Uyaranlarına Fare Genikülat Ganglion Nöron Yanıtlarının İn vivo Kalsiyum Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, anestezi uygulanmış bir farede cerrahi olarak maruz kalan genikülat gangliona tatlar vermek ve gerçek zamanlı nöronal tepkileri görselleştirmek için epifloresan mikroskopi ile GCaMP floresansını kullanmak için bir protokolü gösterir ve periferik tat sinyali işleme çalışmalarına yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tastant panel
   1. Genkülatın üzerinden sıvıyı çıkarmak için emme kullanın. İsteğe bağlı olarak, sızıntıyı azaltmaya ve mikroskop navigasyonuna yardımcı olmak için bir emici nokta yerleştirin.
   2. Hayvanı mikroskop altında emici bir ped üzerine yerleştirin. Genikülat ganglionu bulun: yararlı yer işaretleri arasında bullada kalan delik, temporal kemikteki delik ve yedinci sinir bulunur. Epifloresan kapsamındaki FITC / GFP (Floresein İzotiyosiyanat / yeşil floresan protein) filtresini kullanarak, bireysel GCaMP eksprese eden genikülat ganglion nöronlarını kontrol edin. 10x'lik bir objektif (10 mm'lik çalışma mesafesi), tek tek hücrelerin aktivitesini izlemek için yeterli çözünürlüğü sağlayacaktır, ancak 20x'lik bir objektif (12 mm'lik çalışma mesafesi) de kullanılabilir.
   3. Dövme hattı için dağıtım iğnesini hayvanın ağzına sıkıca yerleştirin. Sıvıyı yakalamak için hayvanın ağzının altına bir Petri kabı yerleştirin.
   4. Kameranın mikroskobun görüş alanını görüntülediğinden emin olun. Video kaydının başlangıcını tastant sunumunun başlangıcı ile senkronize edin.
   5. Kayıt sırasında yanıtlar, sapma ve sızıntı için canlı yayını izleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1ml Luer kilitli şırınga	Fisher Scientific	14-823-30
27 Gauge Künt Dağıtım İğnesi	Fisher Scientific	NC1372532
Emici Noktalar	Fisher Scientific	50-930-668
Asesülfam K	Fisher Scientific	A149025G
BD Kalıcı Olarak Takılı İğneli Alerji Tepsileri	Fisher Scientific	14-829-6D
Künt Ekartörler	FST	18200-09
Breadboard	Thor Labs	MB8
Özel Baş Direk Tutucu	eMachineShop		Ekteki 202410.ems dosyasına bakın
Özel Metal Kafa	Direği eMachineShop		Ekteki dosyaya bakın 202406.ems
DC Sıcaklık Kontrol Cihazı	FHC	40-90-8D
Dijital Kamera, sCMOS OrcaFlash4 Mikroskoba Monte	Hamamatsu	C13440
Diseksiyon Kapsamı	Leica	M80
LED Soğuk Işık Kaynağı	Leica Mcrosystems	KL300LED
Luer Lock 1/16" Boru Adaptörleri	Fisher	01-000-116
Mikroskop	Olympus	BX51WI
Mini Seri Optik Direkler	Thorlabs	MS2R
Petri kapları	Fisher Scientific	FB0875713A
Basınçlı hava	Airgas	AI Z300
Kendinden Yapışkanlı Etiketleme Bant	Fisher Scientific	159015R
Silikon Sıkıştırma Vana Boru 1/32 "x 1/16" od (ayak başına)	Otomatikleştir Bilimsel	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Öğrenci İnce Makas	Güzel Bilim Araçları	91460-11
Cerrahi Prob	Roboz Cerrahi Mağaza	RS-6067
Cerrahi Prob Tutucu	Roboz Cerrahi Mağaza	RS-6061
BD Intramedic Boru	Fisher Scientific	22-046941
İki Kademeli Gaz Regülatörü	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon vinil boru - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 dijital/manuel kontrolör	Otomatikleştirin Bilimsel	01-18
Valvelink8.2 Pinch Valf Perfüzyon Sistemi	Otomatikleştirin Bilimsel	17-pp-54
Ksilazin	Anased	NADA # 139-236