Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörleri Kullanılarak Nörotransmitter Salınımının Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Lacin, E., et al. Nörotransmiterlerin In Vivo'da Optik Tespiti için Hücre Tabanlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörlerinin (CNiFER'ler) Yapımı. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, fare korteksine önceden enjekte edilmiş özel raportör hücreleri olan hücre bazlı nörotransmitter floresan mühendislik raportörleri (CNiFER'ler) kullanarak in vivo nörotransmitter salınımını görüntülemek için bir tekniği göstermektedir. İki fotonlu bir mikroskop altına yerleştirilen fare, floresan emisyonu yoluyla nörotransmitter kaynaklı kalsiyum sinyalinin görselleştirilmesine izin verir. Yöntem, CNiFER'ler üzerindeki G-proteinine bağlı reseptörlere nörotransmitter bağlanmasından yararlanarak, nörotransmitter aktivitesini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için kalsiyum salınımını ve floresansı tetikler.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fare Korteksine CNiFER İmplantasyonu:

1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin. % 70 etanol ile silerek ve temiz bir laboratuvar bezi sererek ameliyat için yarı steril bir alan hazırlayın.
2. Dikey bir elektrot çektirmesi üzerinde bir cam kılcal damarı (iç çap 0,53 mm) çekerek CNiFER enjeksiyon pipetini hazırlayın. Elektrotun ucunu ~40 μm çapa kadar kırmak için bir çift No. 5 ince uçlu forseps kullanın.
   Not: Bu en iyi şekilde bir gratikül ile stereo zoom mikroskobu altında gerçekleştirilir.
3. İzofluran içeren bir yetişkin (doğum sonrası 60-90 gün) C57BL / 6 fareyi uyuşturun: indüksiyon için% 4 (h / h) ve bakım için% 1.5 ila% 2.0 (h / v). Farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için kuyruk veya ayak parmağını sıkıştırın.
   Not: Anestezi derinliğini yeniden değerlendirmek için periyodik olarak yeniden sıkıştırın ve ameliyat boyunca bıyık seğirmesini değerlendirin.
4. Kurumayı önlemek için gözleri oftalmik merhem ile örtün. Fareyi kulak çubuklu stereotaksik bir çerçeveye monte edin. Rektal prob tarafından düzenlenen bir ısı yastığı kullanarak fare vücut sıcaklığını 37 °C'de tutun.
5. Bir hayvan elektrikli tıraş makinesi ile yaklaşık 5 mm x 12 mm'lik bir alanı tıraş edin. Betadine ve ardından% 70 (h / h) izopropanol uygulayın. Kafatası yüzeyindeki deriyi kesmek ve çıkarmak için bir neşter bıçağı kullanın. Periosteumu kafatasının yüzeyinden çıkarmak için bir neşter bıçağı kullanın. Stereotaksik cerrahi için tarif edildiği gibi kafatasının yüzeyini açığa çıkarın ve temizleyin.
6. Boş bir cam pipeti bregma'ya indirin ve antero-posterior (A/P) ve medio-lateral (M/L) koordinatları kaydedin. Fare beyin atlasına atıfta bulunarak, enjeksiyon bölgesinin konumunu hesaplayın. Pipeti hedef bölgeye kaydırın ve sonraki pencere oluşumu için kafatasını işaretleyin.
   Not: Enjeksiyon bölgesi ve pencere, incelenecek bölgeye ve kortekste nörotransmitter veya peptit salgılayan projeksiyonların dağılımına bağlıdır. Örneğin, yakın tarihli bir yayında, klasik koşullandırma sırasında dopamin salınımının in vivo görüntülenmesi için CNiFER hücrelerini frontal kortekse enjekte etmek için +1.0 ila +2.0 mm A / P ve +1.0 ila +2.0 mm M / L stereotaksik koordinatları kullanıldı.
7. 2 mm x 3 mm inceltilmiş bir kafatası penceresi oluşturun.
   Not: Penceredeki kemik 15-20 μm kalınlığında olmalıdır. Kemikteki küçük beyaz lekeler, kafatası yüzeyi nemlendirildiğinde, kemik yeterince incelmişse görünmemelidir.
8. Hücreleri enjekte etmeye hazırlarken nemli tutmak için pencereye yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile ıslatılmış bir sünger yerleştirin.
9. Bir T75 şişesinde ~%80 birleşime kadar büyütülen CNiFER klonunu hasat edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Not: Bu adımlar için tripsin atlanmıştır.
10. PBS'yi çıkarın ve şişenin dibindeki hücreleri çıkarmak için 10 ml ACSF kullanın. Hücre kümelerini ayırmak için hücreleri tritüre edin. Peleti 100 μl ACSF'de santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. 1.400 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın, ACSF ile kaplı bir pelet bırakın. Bu adım, süspansiyon halinde bir hücre kümesi bırakır.
11. Adım 1.2'de hazırlanan enjeksiyon pipetini mineral yağ ile doldurun, pipeti bir nanoenjektöre yükleyin ve küçük bir yağ damlası çıkarmak için pistonu ilerletin. 5 μl CNiFER hücre süspansiyonunu, fare hazırlığının yanındaki bir plastik parafin film şeridine koyun. CNiFER'leri veya kontrol CNiFER hücrelerini çekilen pipete çekin.
12. Pipeti hedef X ve Y koordinatlarına, yani adım 1.5'te belirtilen A/P ve M/L'ye getirin. Pipeti indirin, inceltilmiş kafatasını delin ve CNiFER hücrelerini korteksin 2 / 3 katmanlarında biriktirmek için kafatası yüzeyinin ~ 200-400 μm altına devam edin.
13. Nanoenjektör ile en derin bölgeye ~ 4.6 nl CNiFER hücresi enjekte edin, yağ ve hücre arayüzündeki hareketi not edin ve ardından hücrelerin dağılması için 5 dakika bekleyin. Pipeti ~100 μm geri çekin ve ~4.6 nl başka bir CNiFER hücresi enjekte edin, 5 dakika bekleyin. Ardından CNiFER'lerin geri akışını önlemek için pipeti yavaşça ve nazikçe geri çekin. Enjeksiyonları bir veya daha fazla bitişik bölgede tekrarlayın.
14. Kontrol HEK293 hücreleri ile enjeksiyon adımları 1.8-1.12'yi tekrarlayın (yani, G proteinine bağlı reseptör [GPCR] eksik HEK293 / TN-XXL / Gqi5 klonu). CNiFER'i ayırın ve hücre enjeksiyon bölgelerini ~ 200 μm kontrol edin.
15. Hücre implantasyonlarını tamamladıktan sonra, inceltilmiş kafatası penceresini ACSF ile durulayın ve kafatasının kurumasını bekleyin. Pencerenin üzerine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı sürün (Malzemelere bakın) ve yapıştırıcının üzerine önceden kesilmiş steril bir kapak camını hızlı bir şekilde yerleştirin. Kapak camını birkaç saniye boyunca yavaşça kafatasına doğru itin. Tutkalı 2 dakika kurumaya bırakın.
16. Kapak camının kenarlarını diş çimentosu ile kapatın ve daldırma hedefi için su tutmak için pencerenin etrafında bir kuyu oluşturun.
17. Görüntüleme sırasında farenin kafasını hareketsiz hale getirmek için, pencerenin arkasına küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ile özel yapım bir kafa çubuğu takın. Yapıştırıcının iyice kurumasını bekleyin ve ardından özel yapım kafa çubuğunu daha da güçlendirmek için ilave diş çimentosu ekleyin.
18. Pencere hariç kafatası yüzeyinin geri kalanını bir diş çimentosu tabakası ile kaplayın. Cildin kenarlarının çimento ile kaplandığından emin olun ve 20 dakika kurumasını bekleyin.
19. Ameliyattan sonra, izofluran uygulamasını durdurun ve fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar bir kafes içinde bir ısıtma yastığı üzerinde bırakın. Rehidrasyon için salin (deri altı [sc]) içinde% 5 (a / h) glikoz ve ameliyat sonrası analjezi için 0.05 ila 0.1 mg / kg buprenorfin (intraperitoneal [ip], anında salım) enjekte edin.
    Not: İnsan CNiFER'lerine karşı potansiyel immünolojik reaksiyonu en aza indirmek için, CNiFER'lerin enjeksiyonundan bir gün önce başlayarak fareye günlük olarak 20 μl / 100 g siklosporin (ip) enjekte edin.
20. Fareyi yiyecek ve su için ev kafesine geri koyun.

2. CNiFER Klonlarının İn Vivo Görüntülemesi

Not: Canlı görüntüleme, iki fotonlu bir mikroskop ve başa sabitlenmiş bir aparat kullanılarak farelerle gerçekleştirilir. Görüntüleme seansları sırasında herhangi bir anesteziye ihtiyaç duyulmaz. Uyanık durumdaki hayvanları görüntülerken, stres seviyelerini azaltmak için baş desteğini bir seferde yalnızca birkaç saatle sınırlayın. Hayvanı, yiyecek ve su için görüntüleme seansları arasında eve kafese geri koyun. Oda ışıkları karartılarak ve farenin bir muhafaza içindeki kısmı karartılarak potansiyel stres en aza indirilir.

1. Ameliyattan sonraki gün, kafatasına implante edilen metal kafa çubuğunu kafa sabitleme çerçevesine vidalayarak fareyi bir görüntüleme platformuna monte edin.
   Not: Uyanık fareleri görüntülerken, baş desteği cihazının neden olduğu potansiyel stres nedeniyle görüntüleme seansı birkaç saati geçmemelidir.
2. Görüntüleme platformunu, başı sabitlenmiş fare ile 10X (0.30 NA) ve 40X (0.80 NA) suya daldırma objektifleri ile donatılmış iki fotonlu bir görüntüleme mikroskobuna yerleştirin.
3. Floresan rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme (Gelişmiş Camgöbeği, Floresan Proteini [eCFP] ve Sitrin) için 505 nm'de dikroik bir aynaya ve eCFP ölçümü için 460 nm ila 500 nm ve Sitrin ölçümü için 520 nm ila 560 nm arasında bant geçiren filtrelere sahip filtre küpünü yerleştirin.
4. İnceltilmiş kafatası penceresi içeren kuyuya ACSF ekleyin ve suya daldırma hedefini ACSF'ye indirin. Pencerenin altındaki korteks ve damar sisteminin yüzeyini bulmak için göz merceğini bir cıva lambası ve yeşil floresan protein (GFP) filtre küpü ile birlikte kullanın.
   Not: Damar sisteminin deseni, tekrarlanan görüntüleme günlerinde aynı bölgenin bulunmasına ve görüntülenmesine yardımcı olur. GFP filtre küpü ve bir cıva lambası kullanarak hücreler üzerindeki korteksin yüzeyine manuel olarak odaklanarak CNiFER'leri bulmak için 40X suya daldırma hedefine geçin.
5. İki fotonlu görüntüleme için ayarlayın. İki fotonlu görüntüleme için uygun ışık yolunu seçin. Tipik bir ticari sistem için, iki fotonlu görüntüleme moduna geçmek ve ışığı, taranmamış dedektörlerdeki fotoçoğaltıcı tüplere (PMT'ler) yönlendirmek için yazılımı kullanın. Yakın kızılötesi femtosaniye darbeli lazeri açın, 820 nm'lik bir dalga boyu ve% 5-15'lik bir güç ayarı seçin.
   Not: %5 güç, numunede tipik olarak ~25 mW sağlar.
6. PMT1 ve PMT2 voltajını maksimum değere, PMT'ye bağlı olarak tipik olarak 700-1.000 V'a yakın bir değere ayarlayın. Her kanal için kazancı 1'e ayarlayın ve hedef için z konumunu sıfırlayın.
7. Hedefi kortikal yüzeyden ~ 100 ila 200 μm düşürün ve xy taramasını başlatın. CNiFER floresansının sinyal-gürültü oranını optimize etmek için her kanal, yani eCFP ve Sitrin'in lazer gücünü, kazancını ve PMT voltajını ayarlayın.
8. Görüntüyü, CNiFER hücrelerini içeren bir bölgenin yanı sıra bir arka plan bölgesiyle sınırlamak için yazılımdaki yakınlaştırma özelliğini kullanın. Piksel başına 2 μs'de her 0.5 saniyede bir (4 Hz) bir kareden daha yavaş olmayan bir tarama hızı kullanın. Uygun sinyal-gürültü oranı için hat ortalamasını ayarlayın, örneğin Kalman 2 hat ortalaması.
9. CNiFER hücrelerinin etrafına, düzlem başına yaklaşık 3 ila 4 hücreyi çevreleyen bir ilgi bölgesi (ROI) çizin. ROI ortalama yoğunluklarının gerçek zamanlı analizini ayarlayın. Zaman içinde CNiFER floresansını izlemek için satın almaya başlayın.
10. Deneysel manipülasyonlardan önce ve sırasında CNiFER'lerden floresan toplayın, ör., elektriksel stimülasyon, Channelrhodopsin-2 (ChR2) stimülasyonu, kullanıcı tarafından belirlendiği gibi davranış.
11. Görüntüleme deneyi tamamlandığında, fareyi ana kafesine geri koyun. Görüntülemeyi istediğiniz gibi günler boyunca tekrarlayın. Hücreleri yeniden görüntülerken, aynı görüntüleme alanına geri dönmek için daha önce elde edilen düşük büyütmeli damar sistemi görüntüsüne başvurur (adım 2.4).
    Not: İmplante edilen CNiFER'ler en az 7 gün boyunca görüntülenebilir.

Malzemeler