Rekombinant Miyelin Oligodendrosit Glikoproteinlerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Jain, R. W., et al. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit çalışmaları için fare miyelin oligodendrosit glikoproteininin basit ve verimli üretimi ve saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) çalışmalarında kullanılan rekombinant bir Miyelin Oligodendrosit Glikoproteini (MOG) olan MOGtag'ın izolasyonunu ve saflaştırılmasını göstermektedir. Protokol, saflaştırılmış MOGtag elde etmek için bakteriyel liziz, sonikasyon, santrifüjleme ve nikel afinite kromatografisini içerir. Bu protein, multipl skleroz modellerinde B hücresi aracılı otoimmünite araştırmalarını mümkün kılar.

Protokol

1. MOGtag Proteininin Hasat Edilmesi

NOT: Bu aşamada, bakteriler büyük miktarlarda MOGtag proteini üretmiş olacaktır. MOGtag'ı hasat etmek için, bakteriler önce bir Triton X-100 tamponunda parçalanır, ardından sonikasyon yapılır. MOGtag daha sonra inklüzyon cisimciklerinden salınır ve imidazol ve guanidin ile denatüre edilir, bu da MOGtag proteinini içeren ham bir protein çözeltisi ile sonuçlanır.

1. Gece boyunca kültürlerden birinden 1 ml'lik bir alikot alın ve 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 1 dakika boyunca 16.000 x g'da pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın. Tüpü TO/N (indüksiyon sonrası) olarak etiketleyin, ardından bakteri peletini gelecekteki SDS sayfa analizi için -20 °C'lik bir dondurucuya koyun (Şekil 2).
2. Kültürleri yüksek hızlı santrifüjleme ile uyumlu 250 ml'lik şişelere eşit olarak dağıtın ve bu noktadan itibaren buz üzerinde tutun. Bakteri hücrelerini 22.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca peletleyin.
3. Süpernatanı atın. Bakteri peletlerini -20 °C'de saklayın veya adım 1.4'e geçin.
4. 60 μl Triton X-100 ve 120 μl 50 mg / ml tavuk yumurtası lizozim stok çözeltisine 60 mL PBS'ye ekleyerek lizis tamponu (0.1 mg / ml tavuk yumurtası lizozim, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 Triton-X (h / v)) hazırlayın.
5. Adım 1.3'teki tüm bakteri peletlerini toplam 30 ml lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve birleştirin. Bu hacmi, yüksek hızlı santrifüjleme yapabilen yuvarlak tabanlı 50 ml'lik bir tüpe aktarın. Bu tüpü 30 dakika boyunca 30 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Kuluçka süresi boyunca, hücreleri yeniden askıya almak için tüpü iki kez sallayın.
6. İnkübasyondan sonra, tüpü buzun üzerine aktarın ve çözeltiyi 20 kHz, genlik% 70'te sonikleştirin, 3 saniye boyunca darbe açın, 3 saniye boyunca darbe çekin ve tur başına beş darbe. Çözeltiyi toplam altı tur boyunca sonikleştirin ve çözeltinin turlar arasında buz üzerinde soğumasına izin verin.
7. Çözeltiyi 24.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 1.5-1.7 adımlarını bir kez tekrarlayın. Peleti -20 °C'de saklayın veya adım 1.8'e geçin.
8. 0.8766 g NaCl, 0.09456 g Tris-HCl ve 0.01021 g imidazol ekleyerek tampon A'yı (500 mM NaCl (sodyum klorür), 20 mM Tris-HCl (Tris (hidroksimetil)aminometan hidroklorür), 5 mM imidazol, pH 7.9) 100 ml'lik bir behere hazırlayın. Hacim 28 ml'ye ulaşana kadar su ekleyin, ardından çözeltinin pH'ını 7.9'a ayarlayın. Daha sonra çözeltiyi 100 ml'lik dereceli bir silindire aktarın ve hacim 30 ml olana kadar su ekleyin.
9. Peletleri 30 ml tampon A'da adım 1.7'den itibaren yeniden süspanse edin ve bu çözeltiyi 4 °C'de 3 saat inkübe edin. Bu süre zarfında, 17.2 g guanidin-HCl'yi tartın.
10. Adım 1.6'daki ile aynı ayarları kullanarak çözeltiyi buz üzerinde sonikleştirin. Daha sonra çözeltiye 17.2 g guanidin-HCl ekleyin. MOGtag proteinini çözündürmek için bunu 1 saat buz üzerinde inkübe edin.
11. Çözeltiyi 24.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve süpernatanı protein saflaştırılana kadar 4 ° C'de saklayın.

2. Protein Saflaştırma

NOT: Aşağıdaki adımlarda, MOGtag proteini, yüklü nikel reçinesi (His-tag yoluyla) ve elüsyon üzerine 4 tur absorpsiyon yoluyla saflaştırılacaktır.

1. Aşağıdaki arabellekleri yapın:
   1. Tampon B'yi hazırlayın (500 mM NaCl, 20 mM tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidin-HCl, pH 7.9). 500 ml'lik bir behere 5.844 g NaCl, 0.6304 g Tris-HCl, 0.0681 g imidazol ve 114.64 g guanidin-HCl ekleyin. Daha sonra 190 ml'ye ulaşana kadar su ekleyin ve pH'ı 7.9'a ayarlayın. Çözeltiyi 250 ml'lik dereceli bir silindire aktarın ve hacim 200 ml olana kadar su ekleyin.
   2. Elüsyon tamponu hazırlayın (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M imidazol, 6 M guanidin-HCl, pH 7.9). 500 mL'lik bir behere 5.844 g NaCl, 0.6304 g Tris-HCl, 6.808 g imidazol ve 114.64 g guanidin-HCl ekleyin. 190 ml'ye ulaşana kadar su ekleyin ve pH'ı 7.9'a ayarlayın. Çözeltiyi 250 ml'lik dereceli bir silindire aktarın ve hacim 200 ml olana kadar su ekleyin.
   3. Şerit tamponu hazırlayın (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA (etilen diamin tetraasetik asit), pH 7.9). 500 mL'lik bir behere 5.844 g NaCl, 0.6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA ekleyin. 190 mL'ye ulaşana kadar su ekleyin ve pH'ı 7.9'a ayarlayın. Çözeltiyi 250 ml'lik dereceli bir silindire aktarın ve hacim 200 ml olana kadar su ekleyin.
   4. Şarj tamponu hazırlayın (0.1 M nikel sülfat). 5.257 ml'lik bir behere 500 g nikel sülfat ekleyin ve 190 ml'ye ulaşana kadar su ekleyin (DİKKAT, nikel sülfat suda çözülene kadar nikel sülfatı çeker ocak dışında tutmayın). Nikel sülfat çözüldükten sonra, çözeltiyi 250 ml'lik dereceli bir silindire aktarın ve hacim 200 ml'ye ulaşana kadar su ekleyin.
2. 10 ml nikel reçinesini, 4.500 x g'ın üzerindeki merkezkaç kuvvetlerine (her tüpte 5 ml) dayanabilen iki konik 50 ml'lik santrifüj tüpü arasında bölün.
3. Nikel reçinesini şarj edin ve dengeleyin:
   1. Reçineyi içeren her tüpe 40 ml su ekleyerek reçineyi yıkayın. Tüpleri yatay olarak bir külbütörün üzerine yerleştirin ve 4 °C'de 5 dakika çalkalamaya bırakın. Bitirdikten sonra, tüpleri 4,500 x g'da 4 °C'de 8 dakika santrifüjleyin.
   2. Peletin bozulmasını önlemek için süpernatanı pipetleyerek atın. Her tüpe 40 ml şarj tamponu ekleyin. Tüpleri bir külbütöre aktarın ve 4 °C'de 15 dakika çalkalamaya bırakın. Bitirdikten sonra, tüpleri 4,500 x g'da 4 °C'de 8 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı atın, ardından tüplere 40 ml tampon B ekleyin. Tüpleri bir külbütöre aktarın ve 4 °C'de 5 dakika çalkalamaya bırakın. Bitirdikten sonra, tüpleri 4,500 x g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanları atın.
4. İsteğe bağlı: Adım 1.11'de toplanan çözünmüş proteinden 150 μl alın ve 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü ön inkübasyon olarak etiketleyin ve gelecekteki SDS (sodyum dodesil sülfat) sayfa analizi için bunu -20 °C'de dondurun (Şekil 2, Ham MOGtag).
5. MOGtag Proteinini saflaştırın:
   1. çözünmüş proteinin tüm hacmini adım 1.11'den (~ 40 ml, eksi adım 2.4'te çıkarılan küçük numune) adım 2.3'ten nikel reçinesi içeren ilk tüpe (Şekil 1, tüp 1) aktarın, karıştırın ve 1 saat boyunca 4 ° C'de bir külbütör üzerine yatay olarak yerleştirin.
   2. Tüpü 4,500 x g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Bitirdikten sonra, süpernatanı nikel reçinesinin ikinci tüpüne (Şekil 1, tüp 2) aktarın ve önceki adımda açıklandığı gibi inkübe edin. Bu arada, tüp 1 ile aşağıdaki 3 ila 6 arasındaki adımlarla devam edin.
   3. Nikel reçinesini 40 ml elüsyon tamponunda 1 tüpte yeniden süspanse edin ve tüpü 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir külbütör üzerine yatay olarak yerleştirin. Ardından, tüpü 4,500 ° C'de 8 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   4. Ayrıştırılmış MOGtag proteini içeren süpernatanı 'saflaştırılmış MOGtag proteini' etiketli 250 ml'lik bir şişeye aktarın ve bu şişeyi 4 °C'de tutun. Her elüsyon adımında, elde edilen süpernatanı bu şişede toplayın.
   5. Nikel reçinesine 40 ml şerit tampon ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir külbütör üzerine yatay olarak yerleştirin.
   6. Tüpü 4,500 x g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ardından nikel reçinesini adım 2.3'te listelendiği gibi yeniden şarj edin.
   7. Bitirdikten sonra, adım 2.5'te listelendiği gibi ikinci tüp ile ilerleyin. Çözündürülmüş proteinin adım 1.11'den yüklü nikel reçinesi üzerine toplam 4 tur emilmesi ve elüsyon, proteinin çoğunu geri kazanacaktır, ancak istenirse, ek emilim ve elüsyon turlarında ek protein geri kazanılabilir.
6. Dört (veya daha fazla) emilim ve elüsyon turu tamamlandığında, havuzlanmış saflaştırılmış proteini gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Nikel reçinesi, tekrar ihtiyaç duyulana kadar 4 ° C'de 40 ml'lik %20'lik bir etanol çözeltisi içinde saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Saf MOGtag proteini üretmek için gereken adımlara genel bakış. MOGtag proteinini oluşturmak için, MOGtag proteinini eksprese eden bakteriler yüksek yoğunluklara büyütülür ve daha sonra bölüm 1'de listelendiği gibi IP...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Bu bakteriler MOGtag proteinini yapmak için gereklidir. Bu bakterilerin gliserol stokları istek üzerine temin edilebilir.
LB et suyu değirmeni	Bioshop	LBL407.1
Ampisilin	Bio basic	AB0028	Tozu 100 mg / ml'de% 50 etanol / %50 H₂O'ya yeniden yapılandırın. -20 °C'de saklayın.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Tozu 1M'de H₂O'ya yeniden yapılandırın ve -20 °C'de saklayın.
Tavuk-yumurta lizozim	Bioshop	LYS702.10	50 mg / ml'de H₂O'da sulandırılır ve -80 ° C'de saklanır.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Fosfat tamponlu salin	Yaşam teknolojileri	20012-027	Ticari fosfat tamponlu salin gerekli değildir, herhangi bir standart laboratuvar yapımı fosfat tamponlu salin yeterlidir.
Sodyum klorür	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
İmidazol Bioshop		IMD508.100
Guanidin-HCl	Sigma	G3272	Kalite% 98'den fazla saflıkta olmalıdır.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nikel (II) sülfat	Bioshop	NIC700.500
Bağlama reçinesi	EMD Millipore	69670-3	%20 etanol içinde saklayın 4 °C'de %80 H₂O
Susuz etanol	Ticari Alkoller	P016EAAN	Gerektiği kadar su ile seyreltin.
Buzlu asetik asit	Bioshop	ACE222.1
Sodyum asetat trihidrat	Bioshop	SAA305.500
Sığır serum albümin standardı	bio-rad	500-0206
Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu dihidrat	Fisher scientific	BP120-500
Polietilenglikol 3350	Biyoshop	PEG335.1
polietilenglikol 8000	Biyodükkan	PEG800.1
Sonikatör	Fisher bilimsel	FB-120-110
Sodyum dodesil sülfat	Bioshop	SDS001