Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı Tekniği Kullanılarak İn Vitro Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi

Özet

Kaynak: Han, J., et.al. İn Vitro Periferik Sinir Rejenerasyonu için Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı ile Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi. J. Vis. Uzm. (2024)

Bu video, Schwann hücresi (SC) büyümesini modüle etmek için nanosaniye darbeli elektrik alanı (nsPEF) tekniğinin uygulanmasını göstermektedir. Hızlı elektrik darbeleri, SC membranlarında geçici nanogözenekleri indükleyerek, SC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve nörotrofik faktör sekresyonunu yönlendiren sinyal yollarını aktive eden kalsiyum akışını kolaylaştırır. Bu hücresel tepkiler, aksonal desteği, nöronal sağkalımı ve potansiyel miyelinasyonu artırarak nsPEF'i sinir onarımı için umut verici bir araç olarak vurgular.

Protokol

1. Dondurularak saklanmış RSC96 hücrelerinin çözülmesi

1. : 1 mL hücre süspansiyonu içeren kriyoviyalı 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çalkalayarak çözün ve ardından 4-6 mL tam kültür ortamı içeren bir santrifüj tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın.
2. 3-5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 3 mL tam kültür ortamında yeniden süspanse edin.
3. Hücre süspansiyonunu 6-8 mL tam kültür ortamı içeren bir kültür şişesine (veya tabağına) ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Ertesi gün, mikroskop altında hücre büyümesini ve yoğunluğunu gözlemleyin.

2. Hücre geçişi:

NOT: Hücre yoğunluğu% 80 -% 90'a ulaşırsa, geçiş için hazırdır.

1. Kültür ortamını atın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1-2 kez durulayın.
2. Kültür şişesine% 0.25 (a / h) tripsin-0.53 mM EDTA ekleyin (bir T25 şişesi için 1-2 mL, bir T75 şişesi için 2-3 mL) ve 37 ° C'de 1-2 dakika inkübe edin.
3. Mikroskop altında hücre ayrılmasını gözlemleyin. Çoğu hücre yuvarlaklaşır ve ayrılırsa, şişeyi hızlı bir şekilde çalışma alanına geri koyun, şişeye hafifçe vurun ve sindirimi durdurmak için% 10 FBS içeren 3-4 mL kültür ortamı ekleyin.
4. İçeriği karıştırın, çözeltiyi aspire edin ve 1000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve 1-2 mL taze kültür ortamı ekleyerek ve hafifçe pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.
5. Hücre süspansiyonunu 1: 2 oranında yeni bir T25 şişesine aktarın ve 7 mL kültür ortamı ekleyin.

3. nsPEF cihazının çalıştırılması

:

1. RSC96 hücrelerini 1 mL DMEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve her iki tarafında elektrotlar bulunan kolorimetrik kaplara aktarın.
2. Güç anahtarını açın.
3. Elektrik alanının yoğunluğunu değiştirmek için cihaz üzerindeki düğmeyi çevirerek parametreleri ayarlayın. Bu çalışmada belirlenen şiddetler 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm ve 40 kV/cm'dir.
4. Elektrotları kıvılcımlar görünene kadar dikkatlice döndürün, böylece iki elektrotu hemen ayırmadan önce hücrelerin önceden ayarlanmış alan kuvveti yoğunluklarına göre 5 darbeli nsPEF almasına izin verin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Matsusada Precision Inc.	için Yüksek Gerilim Güç Kaynağı	AU-60P1.6-L
Pipet	Wuhan Xavier Biyoteknoloji A.Ş., LTD
RSC96 Schwann hücreleri	Wuhan Xavier Biyoteknoloji A.Ş., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
nsPEF	Times Mikrodalga Sistemleri	M17/78-RG217

nsPEF için özel kablo