Retrograd Nöronal İzleme için Sıçan Omuriliğine Viral Vektör Enjeksiyonu

Özet

Kaynak: Keefe, K. M., et al. Bir lentiviral vektörün doğrudan enjeksiyonu, sıçan omuriliğindeki çoklu motor yolakları vurgular. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, nöronal yolları izlemek için sıçan omuriliğine yüksek verimli bir retrograd taşıma (HiRet) viral vektörünün enjeksiyonunu göstermektedir. Virüs, sinaptik giriş için glikoproteinlere ve floresan protein kodlayan bir gene sahiptir. İğne omuriliğe yerleştirilir ve virüs süspansiyonu kontrollü bir hızda uygulanır. Viral difüzyon için yeterli zaman tanındıktan sonra iğne nihayet geri çekilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Ameliyat öncesi hazırlıklar

1. : Nanolitre enjektörler için tasarlanmış 3,5 nanolitre cam kılcal pipetler kullanarak ameliyattan birkaç gün önce viral enjeksiyon için çekilmiş cam iğneler hazırlayın. İki iğneli şablonlar oluşturmak için her pipeti üreticinin talimatlarına göre iki adımlı bir iğne çektirmesine çekin.
2. İğne şablonlarının ucunu mikromakas ile yaklaşık 1-2 mm fazla cam keserek inceltin. 30-40 μm açıklıklı iğneleri izole etmek için mikroskop kalibrasyon lamı ile mikroskop altında yaklaşık açıklık boyutunu ölçün.
3. İğne 30° açıyla yerleştirilmişken, 30-40 μm açıklığa ve 45° eğimli açıya sahip bir uç oluşturmak için bir mikropipet toplayıcı kullanın. Kalibrasyon slaytındaki Vernier ölçeğini kullanarak diyafram genişliğini doğrulayın. Kalıntıları temizlemek için esnek bir iğne ekine sahip bir şırınga kullanarak cam iğneden su ve etanol geçirin ve iğneyi düzenli aralıklarla siyah bir kalemle işaretleyin.
4. İğneleri daha önce %70 etanol ile temizlenmiş kapalı bir Petri kabına yerleştirin ve ultraviyole veya UV ışığı altında bir Biyogüvenlik başlığında 30 dakika sterilize edin.
5. İşlemden hemen önce dondurucudan uygun bir hacmi çıkararak yüksek verimli retrograd transport (HiRet) lentivirüsü hazırlayın.
   NOT: Uygun bir hacim, enjeksiyon için gereken miktarı (enjeksiyon başına 1 μL x enjeksiyon sayısı) ve pipetleme ve yükleme kayıplarını hesaba katmak için küçük bir miktar ekstra hacmi içerir. Kullanılmadığı zaman virüsü buz üzerinde taşıyın ve saklayın.
6. Enjektörü mikro pompaya takarak ve Vernier ölçekli bir mikro manipülatöre yerleştirerek hazırlayın.
7. Cam iğneyi hazırlamak için, kırmızı yağ gibi renkli bir boyayı esnek bir iğne ile donatılmış bir şırınga ile dikkatlice yükleyin. İğnede kabarcık kalmadığından emin olun. İğneyi tutarken aseptik bir teknik kullanın ve uca dokunmaktan kaçının.
8. Cam iğneyi enjektöre yerleştirin, iğnenin rondelalara doğru şekilde oturduğundan, enjektör kapağının sıkıca vidalandığından ve çelik enjektör iğnesinin cam iğnenin uzunluğunun yaklaşık 3/4'ü kadar uzatıldığından emin olun. Virüsler daha sonraki bir adımda iğneye yüklenebilir.

2. Anestezi ve cerrahi alan hazırlığı

:

1. Hayvanı dijital bir ölçekte tartın. Gerekli anestezik hacmini belirlemek ve ameliyat sonrası kilonun izlenmesine izin vermek için ameliyat öncesi ağırlığı kaydedin. Bu protokolde yaklaşık 200-250 g ağırlığındaki dişi Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı.
2. İzofluran inhalasyonu veya enjekte edilen bir ketamin / ksilazin çözeltisi (k / x) kullanarak sıçanı uyuşturun. Burada, ketamin intraperitoneal olarak 67 mg / kg'da ve ksilazin 6.7 mg / kg'lık bir dozda enjekte edilir.
3. Ayağınızı sıkıca sıkıştırarak uygun bir anestezi düzlemini onaylayın. Refleksif geri çekilme meydana gelirse, devam etmeden önce birkaç dakika daha bekleyin.
   NOT: Bilinç belirtileri için bıyıkları, gözleri ve solunum hızını da gözlemleyin. Bıyıklar seğiriyorsa, hafifçe dokunulduğunda göz kırpıyorsa veya nefes alma hızlı ve sığsa, protokole devam etmek için anestezik düzlemin daha derin olmasını bekleyin. Ayrıca, laminektomi ve enjeksiyon ameliyatı boyunca bu belirtileri izleyin. Hayvan sığ bir anestezik düzlem gösteriyorsa, orijinal k / x dozajının 1 / 2'sine eşit olan sadece ketamin içeren bir güçlendirici atış uygulayın.
4. Sıçanı, kalçalardan kürek kemiğinin alt açısına kadar dorsal orta hat boyunca tıraş edin. Daha kolay ve daha hassas bir tıraş için hayvanın derisini gergin bir şekilde çekin.
5. Her iki göze de oftalmik merhem sürün.
6. Bölgeyi sterilize etmek için traş edilen bölgeye antiseptik uygulayın. İlk fırçalama için steril gazlı bezi% 5 iyot çözeltisiyle ıslatın ve tüm saçları ve kalıntıları silin. Bunu, hiçbir alana iki kez temas etmeyecek şekilde% 70 etanole batırılmış steril gazlı bez ile tek yönlü bir kaydırma ile takip edin. Aynı tekniği alternatif iyot ve etanole batırılmış gazlı bez ile iki kez daha kullanın.

3. Cerrahi alan ve alet hazırlığı

1. Steril bir alan oluşturmak için steril sargıyı açarak neşter, rongeurlar, sıçan dişi forsepsleri, yaylı makaslar, hemostatlar, orta noktalı kavisli forsepsler ve ekartörler veya ağırlıklı kancalar içeren bir dizi otoklavlanmış cerrahi alet hazırlayın.
2. Bir paket steril cerrahi eldiven açın ve steril eldiven sargısını masanın üzerine yerleştirin. Steril sargının kontaminasyonunu önlemek için bunu kullanılmış aletler için ek bir steril alan olarak kullanın.
3. Steril alana bir # 10 neşter bıçağı bırakın. Bıçağı kanama durdurucularla bir tutamağa sabitleyin. Steril salin, 4.0 kromik katgüt sütür ve koterizatör, steril gazlı bez, steril pamuk uçlu aplikatörler (kas kanamaları için) veya jel köpük veya kemik mumu (kemik kanamaları için) gibi kanamayı kontrol etmek için malzemeleri erişilebilir bir yere yerleştirin.
4. Hayvanı alın ve steril bir beze koyun. İdrarı toplamak için mesanenin altına gazlı bez yerleştirin. Hedef bölgeyi karın altına sarılmış bir havluyla destekleyin. Varsa, özellikle daha uzun prosedürler için steril bezin altına cerrahi bir ısıtma yastığı yerleştirin.
   NOT: Hayatta kalma ameliyatı sırasında sterilite önemlidir. Eldivenli ellerin sterilitesini korumak için elinizde %70 etanol içeren bir sprey şişesi bulundurun ve alet sterilitesi tehlikeye girerse veya bireysel ameliyatlar arasında bir boncuk sterilizatörü kullanın.

4. Vertebral kolonun açığa çıkarılması ve laminektomi bölgesinin belirlenmesi

:

1. Kereste veya L1 omurunu bulmak için son kaburgaya parmakları hafifçe bastırarak cilt kesisinin yapılacağı alanı belirleyin. Bunu bir dönüm noktası olarak kullanarak, kası ortaya çıkarmak için L1'in hemen altında biten # 10 cerrahi neşter ile 3-4 cm'lik bir cilt kesisi yapın. Temiz bir kesi sağlamak için neşter bıçağıyla hafifçe yayarak ve sıkıca bastırarak cildi gergin tutun.
2. Gerekirse yüzeysel yağları forseps ve makasla kesin ve yayın. (Hedef omura bağlı olarak, kasın yüzeysel olarak büyük bir yağ yastıkçığı olabilir veya olmayabilir.)
3. Neşter bıçağının düzlüğü veya bir parmağınızla dikenli süreçleri hissedin. Genellikle, orta hat alanı, her iki tarafta bir "V" beyaz fasya ile özetlenecektir. Sıçan dişi forseps ile bir üst prosese güvenli bir şekilde tutunmak için küçük bir rostral kesim yapın, ardından işlemlere mümkün olduğunca yakın iki uzun, derin kesim yapın. Kesiğin en derin noktasında neşter bıçağı ile omurların sırt yüzeyi hissedilebilir.
4. Görünürlüğü artırmak için yan kasları ekartörler veya ağırlıklı kancalarla bir kenarda tutun. Başlarının şeklini belirlemek için neşter, yaylı makas veya rongeurs ile işlemlerin etrafındaki kasları temizleyin.
   NOT: Omurilik dokusunun gelişimi kemikten daha erken durduğundan, omuriliğin omuriliğin tam uzunluğunu uzatmadığını unutmayın. Bu, hedef omurga seviyesinin farklı adlandırılmış bir omurun altında olabileceği anlamına gelir.
5. Torasik veya T11'i ve bitişik T12 ve T13 süreçlerini bulun.
   NOT: Doğru vertebral seviyeleri hedeflemede yardım, bir sıçan omurilik atlasında ve çok benzer bir vertebral yapıya sahip olan faredeki yer işaretlerini özetleyen önceki çalışmalarda bulunabilir6,33. Orta hatta bir dönüm noktası vermek için T9 gibi rostral dikenli bir süreci rahatsız etmeden bırakın.

5. Laminektomi yapılması

1. Hedef alan doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, T11-T13'ün dorsal yönlerinin laminektomilerini gerçekleştirin. İlk kemik ısırığı için rongeurs yerleştirmek için iyi bölgeler olan intervertebral bağları ortaya çıkarmak için omurları nazikçe yayın. İnce kontrolü artırmak için rongeurları yarı kapalı bir konumda tutun.
2. Rongeurlarla küçük ısırıklar alarak omurların dikenli süreçlerini ve sırt kısmını çıkarın. Omuriliğe zarar vermemeye veya durayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Omuriliği omurlardan uzaklaştırmaya ve omurilik dokusuna çarpma eğilimini azaltmaya yardımcı olmak için sıçan dişi forseps ile hafifçe kaldırın.
3. Orta hat kan damarının görülebilmesi için kemiği orta hattan uzaklaştırın. Omurilik dokusunu net bir şekilde gösteren ve kalıntı içermeyen bir pencere bırakın.
4. Omuriliğe forseps ile hafifçe dokunun. Bazı hayvanlar, anestezik düzlemleri derin olsa bile refleks olarak zıplayabilir. Enjeksiyon prosedürü sırasında atlamayı önlemek için lidokain gibi bir uyuşturucu maddeden birkaç damla doğrudan omuriliğe uygulayın.
5. Stabilize edici forsepsleri spinöz süreçlere, rostral ve kaudal'ı laminektomi penceresine sabitleyerek hayvanı bir omurga tutucusuna sabitleyin. Solunum hareketlerinin etkisini ortadan kaldırmak için omurga tutucuyu kullanarak hayvanın karnını kaldırın. Bu, iğne stabilitesini artıracak ve uygun enjeksiyon derinliğini sağlayacaktır.

6. Virüsün yüklenmesi ve enjektörün yerleştirilmesi

1. Bir parça parafilm üzerine yaklaşık 5 μL pipetleyerek ve iğneyi ucu damlanın içinde olacak şekilde konumlandırarak virüsü enjektöre yükleyin.
2. 20-100 nL/sn hızında 4 μL'ye kadar virüs çekmek için mikro pompayı kullanın.
3. İğnenin ucunun tıkanmadığından emin olmak için denetleyiciyi iğneden az miktarda virüs enjekte edecek ve serbest bırakacak şekilde ayarlayın. Fazla virüsü bir laboratuvar mendili ile silin.
   NOT: Çekilmiş cam pipetlere alternatif olarak çelik iğneli bir Hamilton şırınga kullanılabilir.
4. Mikromanipülatörü Vernier ölçeği görünecek şekilde konumlandırın ve iğneyi omuriliğin orta hattına yerleştirin.
   NOT: Orta hat bazen omuriliğin ön yüzeyinde çalışan büyük bir kan damarı tarafından bulunabilir. Bununla birlikte, bu bireysel sıçanlarda değişebilir ve orta hat hedeflemesi, sağlam bir spinöz süreçle karşılaştırılarak doğrulanmalıdır.
5. Mikromanipülatördeki Vernier ölçeğini kullanarak iğneyi yanal olarak 0,8 mm yönlendirin.
6. İğneyi omuriliğe girinti yapana kadar indirin, ancak dura'yı delmeyin. Hızlı bir büküm hareketi kullanarak, durayı 1,5 mm derinliğe kadar batana kadar iğne ile delin.

7. Virüsün omuriliğe enjekte edilmesi

1. İğne yerleştirildikten sonra, enjektörü 400 nL / dk hızında enjekte edecek şekilde programlayın. Boya cephesinin ilerlemesini gözlemleyerek virüsün omuriliğe girdiğini doğrulayın. Omurilik dokusunda belirgin bir sızıntı veya kabarıklık olmamalıdır. Sızıntı gözlenirse, bu bazen enjeksiyon hızı 200 nL/dk'ya düşürülerek hafifletilebilir.
2. Enjeksiyon bittikten sonra, virüsün difüzyonunu kolaylaştırmak için iğnenin omurilikte 2-5 dakika (enjekte edilen hacme bağlı olarak) dinlenmesine izin verin.
3. İğneyi yavaşça geri çekin ve bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin. L1-L4 omurga dokusunun uzunluğu boyunca yaklaşık 1 mm aralıklarla 6 eşit aralıklı bölgenin her birine 1 μL virüs enjekte edin. Düzgün çalışmaya devam ettiği sürece her enjeksiyon için aynı iğne kullanılabilir.

8. Yara kapatma ve ameliyat sonrası bakım

:

1. Hayvanı omurga tutucusundan çıkarın ve lateral kasları yaymak için kullanılan ekartörleri veya kancaları çıkarın. Kapatmadan önce yaranın tüm kalıntılardan arınmış olduğundan emin olun.
2. 4.0 kromik katgüt sütür kullanarak kası dikin. İç cilt tahrişi olasılığını azaltmak için düğüme yakın dikiş ipliklerini kesin.
3. 9 mm'lik yara klipsleri kullanarak cildi kapatın. Optimum iyileşmeyi sağlamak için, zımbalamadan önce cildin kenarlarını hizalayın.
4. Hayvanı bir su konveksiyonlu ısıtma pedine yerleştirin ve uyanana kadar izleyin.
5. Sıvıları yenilemek için deri altına 5-10 mL steril salin ve enfeksiyonu önlemek için sefazolin gibi bir antibiyotik enjekte edin. Hayvan ayaktayken, onu ev kafesine geri koyun ve ilk analjezikleri sağlayın. Fareleri herhangi bir ağrı ve sıkıntı belirtisi açısından izleyin ve ağrının hafifletilmesi için kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi (IACUC) onaylı prosedürünüze göre tedavi edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
#10 Neşter Bıçakları	Roboz	RS-9801-10	Neşter ile kullanım için.
1 mL Şırıngalar	Becton, Dickinson and Company	309659	Anestezik IP enjeksiyonu, potansiyel anestezik güçlendirici atışlar ve antibiyotik enjeksiyonları için.
10 mL Şırıngalar	Becton, Dickinson ve Company	309604	Ameliyat sonrası hayvana salin enjekte etmek için.
4.0 Kromik Katgüt Sütür	DemeTECH	NN374-16	Kapanış sırasında kasları yeniden bağlamak için.
48000 Mikropipet Beveler	World Hassas Aletler	32416	Fonksiyonel cam iğneler oluşturmak için çekilen cam kılcal boruların uçlarına eğim vermek için kullanılır.
% 5 İyot Çözeltisi	Purdue Ürünleri LP	L01020-08	Cerrahi bölgenin sterilizasyonunda kullanım için.
%70 Etanol	N/A	N/A	Yeni hazırlanan cam iğnelerin, cerrahi hazırlık sırasında hayvan modellerinin ve ameliyat sırasında cerrahın ellerinin sterilizasyonu ve ayrıca diğer tüm küçük sterilite bakımları için.
Anestezik (Ketamin / Ksilazin Çözeltisi)	Zoetis	240048	Ameliyat sırasında hayvanı doğru bilinç düzleminde tutmak için.
Antibiyotik (Sefazolin)	West-Ward İlaç	NPC 0143-9924-90	Ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için deri altına enjekte edilecek.
Boncuk Sterilizatörü	CellPoint	5-1450	Cerrahi aletleri ısıyla sterilize etmek için.
Bonewax	Güzel Bilim Araçları	19009-00	Kemik kanaması durumunda kemiği kapatmak için.
Koterizatör	Güzel Bilim Araçları	18010-00	Aşırı kan kaybını önlemek için ameliyat sırasında kopan arterleri veya damarları kapatmak için.
Dijital Tartı	Okaus	REV.005	Cerrahi hazırlık sırasında hayvanı tartmak için.
Esnek İğne Eki	Dünyası Hassas Aletler	MF34G-5	Cam iğneleri temizlemek ve cam iğnelere kırmızı yağ yüklemek için.
Jel köpük	Pfizer	H68079	Kemik kanaması durumunda kemiği kapatmak için.
Cam Kılcal Borular	Dünya Hassas Aletler	4878	Çekilmiş cam iğneler için - nanolitre enjektörler için tasarlanmalıdır.
Saç Kesme Makineleri	Oster	111038-060-000	Saçın cerrahi bölgesini temizlemek için.
Kanama durdurucular	Roboz	RS-7231	Cerrahide genel kullanım içindir.
Kimwipes	Kimtech	34155	Cerrahide genel kullanım içindir.
Orta Nokta Kavisli Forseps	Roboz	RS-5136	Cerrahide genel kullanım için.
Vernier Ölçekli Mikromanipülatör	Kanetec	N/A	Ameliyat sırasında hassas hedefleme için.
Mikromakas	Roboz	RS-5621	Yeni çekilmiş cam kılcal borulardan cam fısıltılarını kesmek için.
Işık ve Sürmeli Ölçekli Mikroskop Oküler	Leitz Wetzlar	N/A	Çekilmiş cam kılcal boruların fonksiyonel cam iğnelere eğimini görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	62403	Enjeksiyon hızını kontrol etmek için.
Nanolitre 2000 Pompa Kafası Enjektör	Dünyası Hassas Aletler	500150	Virüsü kontrollü bir şekilde yüklemek ve enjekte etmek.
İğne Çektirme	Narishige	PC-100	Cam iğneler oluşturmak için cam kılcal boruları ısıtmak ve ayırmak için.
Oftalamik Merhem	Dechra Veteriner Ürünleri	RAC 0119	Ameliyat sırasında hayvanın gözlerini korumak için.
Parafilm	Bemis	PM-996	Nanoenjektöre virüs yüklenmesine yardımcı olmak için.
PrecisionGlide İğneleri (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Hayvan modelinin enjeksiyonuna izin vermek için 1 mL ve 10 mL şırıngalarla kullanım içindir.
Sıçan Diş Forseps	Roboz	RS-5152	Dikenli süreçleri kavramak için.
Kırmızı Yağ	N/A	N/A	Enjeksiyon sırasında dokuya giren virüsün görselleştirilmesi için bir cephe sağlamak için.
Ekartörler	Roboz	RS-6510	Cerrahi yarayı açık tutmak için.
Rimadyl Tabletler	Bio Serv	MP275-050	Ameliyat sonrası ağrı yönetimi için.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Ameliyat sırasında omurgadaki kasları çıkarmak için.
Neşter Bıçak Sapı	Roboz	RS-9843	Ameliyat sırasında hayvan modelinin açık derisini ve yağ pedini kesmek için.
Makas	Roboz	RS-5980	Cerrahide genel kullanım için.
Paslanmaz Çelik Yara Klipsleri	CellPoint	201-1000	Kapatma sırasında cerrahi yaranın cildini bağlamak için.
Zımba Çıkarma Forseps	Kent Scientific	INS750347	Zımbaları çıkarmak için, yanlış uygulanmaları gerekir.
Steril Bez	Phoenix Araştırma Ürünleri	BP-989	Operasyon için steril bir yüzey sağlamak.
Steril Pamuk Uçlu Aplikatörler	Puritan	806-WC	Steriliteyi korurken cerrahi yaradaki kanı emmek için.
Steril Gazlı Bez	Covidien	2146	Steriliteyi korurken cerrahi alanı ve cerrahi aletleri temizlemek için.
Steril Salin	Baxter Healthcare Corporation	281324	Kan temizliğinde kullanım ve ameliyat sonrası sıvıların değiştirilmesi için.
Cerrahi Eldivenler	N/A	N/A	Ameliyat sırasında steril alanı korumak için cerrah tarafından kullanılır.
Cerrahi Isıtma Yastığı	N/A	N/A Ameliyat	sırasında hayvan modelinin vücut ısısını korumak için.
Cerrahi Mikroskop	N/A	N/A	Cerrahi yaranın daha iyi görselleştirilmesi için.
Cerrahi Zımba	Kent Scientific	INS750546	Zımbaları uygulamak için.
T / Pompa Isı Terapisi Su	Pompası Gaymar	TP500C	Su konveksiyonlu ısıtma pedine ılık su pompalamak için.
Su Konveksiyonlu Isınma Pedi	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Bilinçsiz hayvanın vücut ısısını korumak için işlem sonrası kurtarma alanında kullanım içindir.
Ağırlıklı Kancalar	N/A	N/A	Cerrahi yarayı açık tutmak için.