Diyabetik sıçan modelinde sinir aksiyon potansiyellerini bloke etmek için yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason

Özet

Kaynak: Lee, YF, et al. Diyabetik sıçan modellerinde sinir iletim bloğu için ultrasonik bir alet. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, diyabetik bir sıçan modelinde siyatik sinirden gastroknemius kasına giden aksiyon potansiyellerini bloke etmek için yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason (HIFU) kullanımını göstermektedir. HIFU ışını sinire iletildikten sonra, kas sinyalindeki bir azalma, HIFU'nun diyabetik nöropatik ağrının giderilmesi için invaziv olmayan bir tedavi olarak potansiyelini doğrular.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Yüksek Yoğunluklu Odaklanmış Ultrason (HIFU) Dönüştürücü ile İn Vivo Sinir İletim Blokajı

NOT: İn vivo deney, 50 mg / kg streptozotosin (STZ) enjeksiyonundan sonra 5. haftada başlar.

1. HIFU sonication ile bileşik kas aksiyon potansiyellerini (CMAP'ler) bloke etmeden önce hayvan prosedürlerini gerçekleştirin.
   1. Ameliyattan önce cerrahi aletleri (neşter, makas, forseps ve cam kanca) otoklavda sterilize edin.
   2. Sıçanları intraperitoneal tiletamin / zolazepam karışımı (40 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) enjeksiyonu ile veya izofluran buharlaştırıcı yoluyla% 1.75 izofluran soluma yoluyla anestezikleştirin. Vücut sıcaklıklarını korumak için fareleri bir ısıtma yastığına yerleştirin.
   3. Sıçanları ventral yaslanma içinde ameliyat için konumlandırın. Göz merhemini uygulayın. Sıçanın bacağını uzatın ve anestezi derinliğini belirlemek için ayağın plantar yüzeyini tırnaklarınızla sıkıştırın. Sıçanlar geri çekilme tepkileri gösteriyorsa, ek anestezi uygulayın.
   4. Elektrikli bir kesme makinesi ile sıçanların uyluğundan ve alt sırtından tüyleri alın. Ameliyat bölgesine temiz gazlı bez ile sıvı iyot uygulayın ve gazlı bezi dairesel olarak ameliyat bölgesinden dışarıya doğru hareket ettirin. Sıvı iyotu aynı dairesel hareketle silmek için bir alkollü ped kullanın. Bu deney sol ve sağ cerrahi bölgelerde gerçekleştirilir. İşlemin bir sonraki adımını gerçekleştirirken işlemi diğer cerrahi bölgede tekrarlayın.
   5. Sırt uyluğunda cildi kesmek için steril bir cerrahi makas veya neşter kullanın. Cildin altındaki dokuyu dikkatlice ayırmak için künt cerrahi makas kullanın ve cildi cilt kancaları ile sabitleyin. Femur kasların içinde görülebilir.
   6. Kaslara gömülü olan uyluk ortası siyatik sinir lifleri görünene kadar uyluk kemiğine paralel kasları dikkatlice ayırmak için makas kullanın. Uyluk ortası siyatik sinirini çevredeki bağ dokularından ve kaslardan ayırmak için dikkatlice bir cam kanca kullanın.
2. Özel yapım bir sinir fiksatörü kullanarak siyatik siniri HIFU odak bölgesine yerleştirin (Şekil 1 ve Şekil 2).
   NOT: Kişiye özel sinir fiksatörü 3 bileşenden oluşur (Şekil 2). Tüm bileşenler şeffaf polimetilmetakrilattan (PMMA) yapılmıştır. Bileşen I'in üst yapısının dış dişi 2,5 mm yüksekliğinde ve M10XP0.7'dir (Şekil 3A). Merkezi kuyu, bileşen I'den geçen 4.0 mm çapında bir deliktir. Kuyunun alt açıklığı bir bant tabakası ile kapatılmıştır. Yuvanın çapı 1,2 mm'dir ve yuvanın merkezi düzlemi ile bileşen I'in üst yüzeyi arasındaki mesafe 3,1 mm'dir. Bileşen II, bir ana gövde, dört ayak ve alt yapıdan oluşur (Şekil 3B). Alt yapının iç dişi 2,5 mm yüksekliğindedir ve bileşen I'in dış dişine uyacak şekilde M10XP0,7'dir. Merkezi deliğin çapı, bileşen I'in merkezi kuyusu ile aynıdır. Ana gövdenin boyutları 32 mm çapında ve 5,4 mm kalınlığındadır. Dört bacak simetrik olarak konuşlandırılmıştır. İki özdeş kısa bacak hizalama için tasarlanmıştır ve iki özdeş uzun bacak, bileşen III'e takılmak için çalışır. Bileşen III'ün dış çapı ve yüksekliği 41 mm ve 9,2 mm'dir. İç diş M36XP1.0'dır ve açık delik 27,5 mm çapındadır (Şekil 3C). Koni, 84 mm çapında bir üst açıklığa ve 27,5 mm çapında bir alt açıklığa sahip içi boş bir koniktir. Yükseklik 57,5 mm'dir (Şekil 4A).
   1. Deneyden önce, özel yapım akrilik sinir fiksatörünü 30 - 60 dakika çamaşır suyu solüsyonunda bekletin, ardından steril suda bekletin.
   2. Bir cam kanca kullanarak, siniri dikkatlice kaldırın ve bileşen I'in yuvasına yerleştirin.
   3. Bileşen II'yi bileşen I'e vidalayın. Bileşen I'in merkezi kuyusunu ultrasonik yayılma ve sinir koruması için Ringer'ın çözeltisi ile doldurun.
   4. Bileşen III'ü HIFU muhafaza konisine vidalayın. Bileşen III'ü bileşen II ile bileşen II'nin dört ayağı boyunca sabitleyin.
      NOT: Üç bileşenin ve dönüştürücünün geometrik merkezi hizalanmıştır. Sinir ve dönüştürücü arasındaki mesafe, sinirin HIFU odak bölgesinin içinde olmasını sağlayan odak uzaklığına eşittir.
3. Bir çift akupunktur iğnesini siyatik sinirin kökenine ve diğer çifti gastroknemius kasına yerleştirin. Her bir iğne çiftini bir elektrik koaksiyel kablo ile elektrofizyoloji toplama sistemine bağlayın (Şekil 1).
   NOT: Kablonun bir ucunda iki iğneyi ayrı ayrı klipslemek için iki timsah klipsi ve kablonun diğer ucunda sistemi bağlamak için bir bayonet Neill–Concelman (BNC) konektörü bulunur. Akupunktur iğneleri çiftleri, siyatik sinirde uyarıcı elektrotlar ve gastroknemius kasında kayıt elektrotları olarak çalışır.
   1. Elektrofizyoloji toplama sisteminin örnekleme hızını ve bant genişliğini sırasıyla 50 kHz ve 70 Hz-3 kHz olarak ayarlayın. Siyatik sinirin orijinindeki uyarıcı elektrotlara 0.1 ms darbe genişliğine sahip supra-maksimal bir uyaran uygulayın.
   2. Kayıt elektrotlarından CMAP'leri kaydedin ve elektrofizyoloji edinim sistemindeki yerleşik amplifikatör ile CMAP'leri yükseltin.
      NOT: Sinir sinyallerini yükseltmek ve kayıt elektrotlarından gelen CMAP'leri elektrofizyoloji edinim sistemi ile kaydetmek için elektrofizyoloji edinim sistemindeki yerleşik amplifikatörü kullanın.
4. Diyabetik nöropatik sıçanlarda CMAP'leri baskılamak için ticari bir 2.68 MHz HIFU dönüştürücü kullanın.
   NOT: Dönüştürücünün özellikleri şu şekilde açıklanmıştır: açıklık çapı 6 cm ve odak uzaklığı 5 cm olan tek elemanlı küresel bir kase ve serbest alanda 4 mm derinlik ve 0,8 mm genişliğinde bir elipsoid odak bölgesi.
   1. Küresel koniyi, HIFU dönüştürücüyü ve koni kapağını gazı alınmış suyla dolu tanka daldırın. HIFU dönüştürücüyü küresel koninin içine yerleştirin ve koni kapağını altı başlı vidayla küresel koninin üst açıklığına sabitleyin (Şekil 4B). Küresel konideki kabarcıklar, suya kıyasla düşük kabarcık yoğunluğu nedeniyle doğal olarak dışarı atıldıktan sonra, koninin ön uç açıklığını şeffaf 0,03 mm kalınlığında bir bantla kapatın. Bileşen III'ü küresel koniye vidalayın.
   2. Küresel koni ve bileşen III ile HIFU dönüştürücüsünü gazı alınmış su deposundan çıkarın.
      NOT: Çalışmada kullanılan ters ozmoz (RO) suyu, ters ozmoz işlemi ile arıtılmış sudur. RO suyu, gazı dışarı atmak için kaynatılır. Soğuduktan sonra, gazdan arındırılmış su, ayrı bir sızdırmaz tankta elde edilir.
5. Bileşen I'i sinir ve kas arasındaki boşluğa dikkatlice yerleştirin ve siniri bileşen I'in boşluğuna yerleştirin. Sinirin HIFU'nun odak bölgesi içinde olduğundan emin olmak için 1.2.3 ve 1.2.4 adımlarını uygulayın (Şekil 2A).
6. Bir fonksiyon üreteci ve bir radyo frekansı güç amplifikatörü bağlayın. Gücü bağlayın ampHIFU ışınını oluşturmak için HIFU dönüştürücüsüne dönüştürücü. Fonksiyon üretecinin voltaj çıkışını, güç amplifikatörü aracılığıyla HIFU dönüştürücüsüne manuel olarak ayarlayın. HIFU maruz kalma süresi dolduğunda işlev oluşturucuyu manuel olarak kapatın. Bir zamanlayıcı kullanarak zamanı gözlemleyin.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan HIFU ışınının yoğunluğu ve enerjisi sırasıyla 2.810 W/^cm2 ve 84 J/^mm2'dir.
7. Eşzamanlı olarak, CMAP'leri kaydederken uyaranı elektrofizyoloji edinim sistemi (adım 1.3) ve HIFU sistemi (adım 1.6) aracılığıyla HIFU ışınını siyatik sinire iletin. Siyatik sinir üzerindeki HIFU maruziyetini, CMAP'lerin genliğinde bir azalma veya inhibisyon gözlenene kadar 3 saniye, 5 saniyeden 8 saniyeye kademeli olarak artırın.
   1. HIFU ışınının iletimi sırasında CMAP'leri saniyede bir kez kaydedin. CMAP'lerin genliğindeki değişimi gözlemledikten sonra, HIFU sistemini kapatın ve CMAP'leri erken 2 dakikada bir her 10 dakikada bir, art arda her 5 dakikada bir her 30 dakikada bir ve kayıt süresi 10 saate ulaşana kadar son aşamada her 2 dakikada bir kaydetmek için elektrofizyoloji edinim yazılımındaki kayıt simgesine manuel olarak tıklayın.
8. HIFU dönüştürücüsünü insizyon bölgesinden çıkarmak için sinir fiksatörünün II ve III bileşenlerini ayırın (Şekil 2). Güvenli siyatik siniri serbest bırakmak için II ve I bileşenlerini ayırın. CMAP'ler kaydedildikten sonra diyabetik sıçanın cerrahi bölgesini 4-0 kromik katgüt sütürlerle dikin. Enfeksiyonu önlemek için ameliyat bölgesine sıvı iyot uygulayın.
   1. Kafesleri ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve fareleri hayvan tesisine geri göndermeden önce kafeslerinde iyileşmelerine izin verin. Sıçanlara 3 gün boyunca içme suyunda ibuprofen veya intraperitoneal buprenorfin enjeksiyonu (0.05 - 0.1 mg / kg) sağlayın.
9. İlk HIFU sonikasyonundan sonraki 7, 14 ve 28. günlerde 1.1.2 ve 1.3 adımlarında açıklandığı gibi anestezik sinirin ve gastroknemius kaslarının kökenine uyarıcı ve kayıt elektrotları yerleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1: Yüksek Yoğunluklu Odaklanmış Ultrason (HIFU) ile In Vivo Sinir İletim Bloğu için Deneysel Düzenek . (A) Ters ozmoz gazı alınmış su ile doldurulmuş özel yapım akrilik küresel bir koni, HIFU dönüştürücüsün...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 edinim sistemi	Biopac Systems, Inc.
HIFU dönüştürücü	Sonic Concepts	H108
Fonksiyon üreteci	Agilent	33250A
Güç amplifikatörü	Elektronik ve Yenilik	1040L
Sıçanlar	Biolasco Tayvan	Sprague-Dawley
Puralube veteriner merhem	Dechra
Isofluran buharlaştırıcı	Parkland Scientific	V3000PS
Isofluran	Attane