Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Özet

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için bir floresan mikroskobu altında gözlemlenir ve spontan nöronal aktivite sırasında kalsiyum akışını yansıtır.

Protokol

1. Görüntüleme için solucanların hazırlanması

1. Agar pedlerinin hazırlanması
   1. 13 mm x 100 mm'lik bir cam kültür tüpünde ve mikrodalgada M9'da moleküler dereceli agarı birkaç saniye çözerek 3 mL %10 agar yapın.
      NOT. Erimiş agar, 1 saate kadar bir ısı bloğunda tutulabilir veya agar pedlerine her ihtiyaç duyulduğunda taze hale getirilebilir.
   2. Her biri iki kat laboratuvar bandı olan iki ek slayt arasına bir mikroskop lamı yerleştirin (bkz. Şekil 1A-i).
   3. 1.000 μL'lik bir pipet ucunun ucunu kesin (filtresiz) ve orta lamel üzerine küçük bir damla agar pipetlemek için kullanın (Şekil 1A-i).
   4. Agarın üzerine başka bir sürgü bastırarak agarı düzleştirin (Şekil 1A-ii).
   5. Soğuduktan sonra, 13 mm x 100 mm'lik bir cam kültür tüpünün (Şekil 1A-iii) açıklığını kullanarak agarı küçük bir disk halinde kesin ve ardından çevreleyen agarı çıkarın.
2. Solucan haddeleme çözeltisinin hazırlanması
   1. 30 mM'lik bir stok oluşturmak için muscimol tozunu M9'da çözün. 50 μL'lik alikotlara ayırın ve 4 °C'de saklayın.
   2. Her 3-5 günde bir 30 mM muscimol'lük yeni bir alikotu çözdürün (ve kullanım sırasında 20 ° C'de saklayın).
   3. Haddeleme çözeltisini yapmak için 30 mM'lik bir muscimol stoğunu polistiren boncuklarla 1:1 oranında seyreltin.
3. Görüntüleme için bir solucan konumlandırma
   1. 1,6 μL haddeleme solüsyonunu agar pedinin ortasına yerleştirin.
      NOT: Sıvı miktarı, daha genç (daha az) veya daha yaşlı (daha fazla) hayvanları görüntülemek için ayarlanmalıdır.
   2. Tercih edilen solucan penasını (yani bir cam veya platin tel kıracağı) kullanarak, çoklu vulva fenotipi olmadan istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma solüsyonuna aktarın (Şekil 1A-iv). not. Temsili veriler 1 günlük hermafroditlerden alınmıştır (GCaMP6f suşu = FJH185; mitoGCaMP suşu; FJH597), sadece bir sıra yumurtanın varlığı ile tanımlanabilir.
   3. Muscimol'ün solucan hareketini azaltması için ~ 5 dakika bekleyin ve ardından agar pedinin üzerine 22 mm x 22 mm'lik bir lamel bırakarak solucan hareketini fiziksel olarak kısıtlayın.
   4. Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, lamel hafifçe kaydırarak solucanı Şekil 1B ve 1C'de gösterilen yöne yuvarlayın.
      NOT. Ventral sinir kordonunu görselleştirmek için, solucanı başı yukarı bakacak şekilde konumlandırın ve solucanı, bağırsak proksimal kısmın sağ tarafında ve solucanın distal kısmı için sol tarafta olana kadar (izleyicinin bakış açısından) yuvarlayın. Dorsal sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için bu yönü (Şekil 1C) ters çevirin.
4. Solucanı bir mikroskop üzerine monte etme
   1. Mikroskop tablasına monte etmeden önce lamel üzerine bir damla daldırma yağı koyun.
   2. Parlak alanda düşük büyütmeli bir objektif (10x) objektif kullanarak solucanı bulun.
   3. 100x hedefine geçin ve odağı ayarlayın.
   4. 488 nm görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mitoGCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.
      NOT: Solucanın ezilmesini veya lamellerin çekilmesini önlemek için küçük ayarlamalar yapın.

2. Yüksek çözünürlüklü görüntü akışlarının elde edilmesi

1. In vivo GCaMP imaging
   1. Pozlama süresini 20 ms olarak ayarlayın.
   2. Bazal GCaMP floresansı kameranın dinamik aralığının orta aralığına gelene kadar görüntüleme lazerini ve çekim ayarlarını yapın. Diğer mikroskopi kurulumlarını kullanarak görüntüleme parametrelerinin optimize edilmesine ilişkin öneriler için tartışmaya bakın.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan optik kurulum için 488 nm görüntüleme lazerini aşağıdaki çıkış ayarlarına ayarlayın: lazer gücü = %50 ve zayıflama = 1. Ek alım ayarlarını aşağıdaki gibi değiştirin: EM elektron çarpma) kazancı = 200 ve ön amplifikatör kazancı = 1.
   3. AVA nörit, 100x büyütmede GCaMP floresan kullanılarak yerleştirildikten sonra, Z-kayma düzelticiyi (ZDC, Malzeme Tablosuna bakın) ±30 μm aralığına ayarlayın ve sürekli otomatik odaklamayı başlatın. Görüntülemeden önce odak düzlemini gerektiği gibi manuel olarak düzeltin.
   4. 100x büyütmede bir görüntü akışı elde edin. Bu çalışmada kullanılan düzenek ile 10 dakikaya kadar süreler elde edilebilir.
2. In vivo mitoGCaMP imaging
   1. Kameranın dinamik aralığı için orta aralıkta bazal mitoGCaMP floresansını elde etmek için gereken 2.1.1- 2.1.2 adımlarını izleyin.
      NOT. Bu çalışmada kullanılan optik kurulum için 488 nm görüntüleme lazerini aşağıdaki çıkış ayarlarına ayarlayın: lazer gücü = %20 ve zayıflama = 10. Alım ayarlarını şu şekilde değiştirin: EM kazancı = 100 ve ön amplifikatör kazancı = 2.
   2. AVA nöritindeki mitokondri, mitoGCaMP floresansı kullanılarak yerleştirildikten sonra, ZDC'yi yukarıda adım 2.3'te açıklandığı gibi ayarlayın.
   3. 100x büyütmede bir görüntü akışı elde edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Ventral sinir kordonunu görüntülemek için C. elegans'ın takılması ve yuvarlanması.(A) Agar pedlerinin hazırlanması ve tek bir solucanın yuvarlanan bir çözelti haline getiril...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100x/1.40 Oil objektif	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objektif	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Kapak camı	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
CleanBench laboratuvar masası	TMC		Titreşim kontrollü
Filtre tekerleği veya kaydırıcı	ASI		25 mm çaplı filtreler için
FJH 185	Caenorhabditis Genetik Merkezi	FJH 185	Solucan suşu
FJH 597	Caenorhabditis Genetik Merkezi	FJH 597	Solucan suşu
GFP bant geçiren emisyon filtresi	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm çap)
ILE lazer birleştirici	Andor Teknolojileri		4 lazer çizgileri
İLE katı hal 488 nm lazer	Andor Teknolojileri		50 mW
IX83 İplik diski konfokal mikroskop	Olympus		Yokogawa CSU-X1 eğirme diski
iXon Ultra EMCCD kamera	ileAndor Teknolojileri
Düşük otomatik floresan daldırma yağı	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Moleküler Cihazlar		Sürüm 7.10.1
Mikroskop kontrol kutusu	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biyomedikal / Sigma	02195336-CF
Polybead mikro küreler	Polibilimler A.Ş.	00876-15	0,094 μm
Stabilite odası	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	15 °C'ye ayarlayın
Sahne kontrolörü	ASI		Filtre tekerleği kontrollü
Standart mikroskop sürgüsü	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Dokunmatik panel denetleyicisi	Olympus		I3-TPC
Z-drift düzeltici	Olympus		IX3-ZDC2

dijital fotoğraf makinesi