$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. P0-P2 fare beyninin çıkarılması
- Prosedüre başlamadan hemen önce, birkaç petri kabını soğutulmuş, karbonhidratlı sükroz yapay beyin omurilik sıvısı (sACSF) ile doldurun. Ayrıca toplama tüp(ler)ini ~ 25 mL sACSF ile doldurun.
- Doğum sonrası 0 ila 2 (P0-P2) yavrusunu bir miktar parafilm veya eldivene sarın ve buzun altına iyice örtün. 5 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın ve başlatın. Bu süreden sonra, yavruyu çıkarın ve arka pençenin sıkışmasına tepki vermediğini kontrol edin.
- Yavrunun kafasını kesin ve kafayı sACSF ile doldurulmuş bir petri kabında toplayın. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi orta hat boyunca kesin.
- Kafatasındaki arka beyin / omurilikteki açıklığı bulun ve forsepsin bir ucunu kafatasının dorsal kısmı boyunca yerleştirin. Kafatasını orta hattan nazikçe kavrayın ve beyne zarar vermemeye dikkat ederek beyni açığa çıkarmak için parçaları yanal olarak 'soyun'.
- Kafatasının dorsal ve yan kısımlarının çıkarılmasından sonra, herhangi bir alana zarar vermemeye çalışarak, beynin ventral yüzeyinin altına kepçe yaparak beyni kafatasından nazikçe çıkarmak için forseps veya spatula kullanın. Beyni karbonhidratlı sACSF ile doldurulmuş başka bir petri kabına yerleştirin. not: Hipokampus, striatum ve korteksi diseksiyon için iki farklı strateji sunuyoruz. İlk strateji (adım 2.1-2.10) herhangi bir fare hattı için yararlıdır, oysa ikinci strateji (adım 3.1-3.7) striatumu globus pallidus ve diğer beyin yapılarından temiz bir şekilde ayırmak için floresan bir raportör fareye ihtiyaç duyacaktır. Striatum istenmiyorsa, iki tekniğin striatuma özgü kısımlarını göz ardı
edin
2. Striatum, Hipokampus ve Korteks Hasadı, Teknik # 1
- Tüm beyni, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde matris kalıbının üzerine yerleştirin. 1 tıraş bıçağını beynin en ön kısmına (ön koku alma yolundan) yerleştirin.
- 0,5 mm'lik bir dilim oluşturmak için ilkinin hemen arkasına başka bir tıraş bıçağı yerleştirin ve bunun arkasına ek bir tıraş bıçağı yerleştirin.
- Bu dilimleri karbonhidratlı sACSF içeren bir petri kabına aktarın ve beynin geri kalanını sACSF içeren ayrı bir kaba koyun. Striatumu görselleştirmek için striatal dilimleri bir diseksiyon kapsamına aktarın. Bu dilimler anterior striatumun büyük kısımlarını içermeli ve hipokampustan yoksun olmalıdır. Nkx2.1-Cre+/- ile bir floresan diseksiyon kapsamı kullanın; Ai9+/- zayıf striatal tdTomato sinyalini globus pallidusun güçlü tdTomato sinyalinden ayırt etmek için dilimler.
- Floresan olsun ya da olmasın, striatumu her iki yarım küreden tüm bölümlerde sıkıştırın ve striatal parçaları sACSF ile uygun şekilde etiketlenmiş 50 mL'lik tüpe aktarın, buz üzerinde saklayın.
- Forseps veya tıraş bıçağı kullanarak beyni orta hat boyunca kesin ve yarım küreyi medial yüzey yukarı bakacak şekilde yatırın.
- Ventral beyin dokusunu (talamus, bazal gangliyonlar vb.) bu dokuyu forseps ile sıkıştırarak çıkarın. Tamamlandığında, hipokampus (dorsal korteks boyunca anteroposterior ekseni kapsayan sosis şeklindeki bir yapı) ve korteksin ventriküler tarafı açıkça görülebilmelidir.
- Hipokampusu çıkarmak için, forsepsin uçlarını ön hipokampusun önüne yerleştirin ve forsepsleri arkaya doğru hareket ettirerek ve hipokampal-kortikal sınır boyunca sıkıştırarak hipokampusu korteksten nazikçe ayırın. İzole edilmiş hipokampusu sACSF ile uygun şekilde etiketlenmiş 50 mL'lik tüpe aktarın, buz üzerinde saklayın.
- Korteksi incelemek için, hemiseke edilmiş korteksi medial tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Ardından, ~ 2 mm x 2 mm'lik kare bir medial somatosensoriyel korteks parçası bırakmak için korteksin en dorsal, ventral, ön ve arka kısımlarını sıkıştırmak için forsepsleri kullanın. Korteksi medial taraf yukarı bakacak şekilde çevirin ve gerekirse medial yüzeydeki fazla kortikal olmayan dokuyu (talamus, bazal ganglionlar, vb.) temizleyin. Korteks yığınını sACSF ile uygun şekilde etiketlenmiş 50 mL'lik tüpe aktarın, buz üzerinde saklayın.
- Hem hipokampus hem de korteks bölgelerini toplamak için işlemi diğer yarım küre ile tekrarlayın.
- Bu prosedürü tüm yavrular için tekrarlayın, sACSF'nin soğuk ve taze kalmasını sağlamak için yavrular arasındaki petri kaplarındaki sACSF'yi değiştirdiğinizden emin olun.
3. Striatum, Hipokampus ve Korteks Hasat Edin, Teknik # 2
- Beynin ventral tarafını sACSF içeren sylgard kaplı bir petri kabına yerleştirin ve beyincik ve ön korteks veya koku ampullerinden geçirin.
- Bir yarım küreden başlayarak, arka korteksi alttaki hipokampus ve diğer dokulardan nazikçe ayırmak için kavisli forseps kullanın. Soyulmuş korteksi nazikçe petri kabının üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Diğer yarım küre için tekrarlayın. Hipokampus ve striatum açıkta kalan beyinde açıkça görülebilmelidir.
- Orta hatta bir hipokampusu sıkıştırmak için forseps kullanın ve çıkarmak için hipokampusu yanal olarak soyun. Toplama şişesine buz üzerine yerleştirin ve diğer hipokampus ile tekrarlayın.
- Striatum için, çevreleyen dokudan gevşetmek için striatumun kenarlarını nazikçe kazıyın. Daha sonra striatumu alttan sıkıştırarak çıkarın ve buz üzerindeki toplama tüpüne ekleyin. Diğer striatum için tekrarlayın.
- Kortikal bölümler adım 2.8'de tarif edildiği gibi hasat edilebilir.
- Transgenik bir raportör fare hattı kullanılıyorsa (örneğin, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, vb.), striatumu sACSF ile bir petri kabına aktarın ve floresan diseksiyon kapsamı altında görüntüleyin. Striatumdan striatal olmayan herhangi bir dokuyu çıkarmak için forseps kullanın (Nkx2.1-Cre'de; Ai9 fareleri, globus pallidus'un striatuma kıyasla çok daha yüksek medial ganglionik üstünlüğü veya MGE'den türetilmiş, tdTomato+ hücre yoğunluğuna sahip olması nedeniyle tüm 'parlak' dokuyu çıkarır). Tüm striatum için tekrarlayın.
- Bu prosedürü tüm yavrular için tekrarlayın, sACSF'nin soğuk ve taze kalmasını sağlamak için yavrular arasındaki petri kaplarındaki sACSF'yi değiştirdiğinizden emin olun.
4. Tek Hücre Ayrışmalarının Oluşturulması
- Diseksiyon tamamlandıktan sonra, 10 mg Pronaz tartılarak ve 10 mL karboksijenlenmiş sACSF içinde çözülerek 1 mg / mL Pronaz çözeltisi hazırlayın.
- Dokuyu 50 mL toplama şişelerinden 2 mL Pronaz-sACSF çözeltisi içeren 5 mL yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Dokuyu oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, numuneleri karıştırmak için inkübasyon sırasında tüpü parmağınızla 3-4 kez sallayarak / hafifçe
vurun.- Bu inkübasyon sırasında, Sulandırma çözeltisi hazırlayın:% 1 fetal sığır serumu (FBS, 100 μL) + DNAse (1 μL 1: 10.000 stok DNAse) 10 mL karboksijenli sACSF'de.
- 20 dakika sonra, alttaki dokuyu rahatsız etmemek için pronaz solüsyonunu dikkatlice çıkarın ve 1-2 mL Sulandırma solüsyonu ile değiştirin (toplam hacim başlangıç doku miktarına bağlıdır).
- Dokuyu önceden hazırlanmış ateşle parlatılmış Pasteur pipetleri ile tritüre ederek dokuyu mekanik olarak ayırın. Büyük delikli (~ 600 μm) pipetten başlayarak, dokuyu parçalamak için doku solüsyonunu en az on kez aspire edin ve dışarı atın. Çözeltiye kabarcıklar sokmayın. Orta delikli pipet ve küçük delikli pipet için bu işlemi tekrarlayın. Çözelti bulanık olmalı ve toplama tüplerinde net bir doku parçası görünmemelidir.
- Hücre kümelerini çıkarmak için hücre lizat çözeltisini 50 μm'lik bir filtreden 5 mL'lik konik tüplere pipetleyin. Akış sitometrisi için bu tek hücreli çözeltilerle devam edin (veya sıralama gerekmiyorsa potansiyel olarak doğrudan hücre sayımına).
5. Transplantasyon için Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama (FACS) ile saflaştırılmış hücre çözeltilerinin hazırlanması
- Akış sitometresinden hücre çözeltilerini aldıktan sonra, çözeltiyi bir (veya birden fazla) 1.5 mL konik tüpe aktarın ve hücreleri 500 g'da 4°C'de 5 dakika döndürün. Santrifüjlemeden sonra, tüpte ~ 20-40 μL kalacak şekilde ortamı çıkarın. Bu kalan ortamdaki hücreleri yeniden oluşturun (ve birden fazla tüpe ihtiyaç duyulursa çözeltiyi birleştirin).
- Küçük bir parafilm parçası üzerinde 2 μL hücre çözeltisi + 8 μL sACSF + 10 μL tripan mavisi boyasını karıştırın. Sürgülü kapaklı bir hemositometreye 10 μL pipetleyin.
- Hemositometrenin köşelerindeki 4 x 4 kare ızgaraların her birindeki canlı hücrelerin sayısını standart bir laboratuvar el çetele sayacı kullanarak sayın (ölü hücreler boyadan mavi olacaktır) ve bu 4 sayımın ortalamasını alın. μL başına hücre sayısını belirlemek için bu sayıyı 100 ile çarpın.
- Gerekirse, hücreler Sulandırma solüsyonunda 10.000-30.000 hücre / μL konsantrasyonda olacak şekilde hacmi ayarlayın. Nihai konsantrasyon, toplam hücre miktarına ve istenen transplantasyon sayısına bağlıdır. Nakil için hücreleri buz üzerinde tutun
6. P0-2 WT Yavrularına Transplantasyon
:
- Vahşi tip (WT) bir yavruyu bir miktar parafilm veya eldivene sarın ve buzun altına iyice kaplayın. 5 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın ve başlatın. Bu süreden sonra, yavruyu çıkarın ve arka pençenin sıkışmasına tepki vermediğini kontrol edin.
- Yavru buz üzerindeyken, yüklemeden önce hücre süspansiyonunun iyice karıştığından emin olmak için hücre çözeltisini birkaç kez pipetleyerek karıştırın (her enjeksiyon için mikropipeti yüklemeden önce hücreleri karıştırın). Daha sonra mineral yağın mikropipetini boşaltın ve hücre süspansiyonu ile tamamen doldurun.
- Anestezi uygulanmış yavruyu, başı yapışkan macunun üzerine gelecek şekilde petri kabının üzerine yerleştirin, böylece başın üst kısmı nispeten düz olur. Elmas delikli bandı yavrunun kafasına yerleştirin, cildin gergin olduğundan ve başın sağlam olduğundan, ancak farenin rahat olduğundan ve iyi nefes aldığından emin olmak için gergin bir şekilde çekin. Lambda elmas deliğinden görünür olmalıdır.
- Güvenli yavruyu Nanoject'in altına getirin ve mikropipetin ucu doğrudan lambda'nın üzerinde olacak şekilde mikropipeti indirin. Manipülatördeki xy koordinatlarını kaydedin.
- Mikropipeti başın mediolateral ve anteroposterior ekseni boyunca istenen koordinatlara hareket ettirmek için manipülatör düğmelerini ayarlayın: birincil somatosensoriyel korteks veya S1 Korteks → 1.0 mm ön ve 1.0 mm lateral, Hipokampus → 0.75-1.0 mm ön ve 1.0-1.2 mm lateral, Striatum → 2.0-2.2 mm ön ve 1.5 mm lateral. Koordinatlar, yavrunun yaşını (örneğin, P0 ve P2) veya farelerin türünü (örneğin, CD1 fareleri P2'de C57 / B6'dan daha büyüktür) telafi etmek için hafifçe ayarlanabilir.
- Mikropipeti cilt üzerinde küçük bir içbükeylik oluşturana kadar indirin. Ardından, mikropipeti beyne girmek üzere deriden ve kafatasından geçirmek için z ekseni manipülatör düğmesini sıkıca ama nazikçe çevirin. Mikropipet beyne girdiğinde, kafatası üzerindeki basınç serbest bırakılacak ve içbükeylik kaybolacaktır.
- Mikropipeti, ucu çadır şeklinde bir deri konisi ile çevrelenene kadar hafifçe geri çekin. Z eksenleri boyunca koordinatları okuyun: Bu, z ekseni sıfır noktası olacaktır.
- Mikropipeti istenen derinliğe indirin: Korteks → 0,75-1,0 mm, Hipokampus → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2,0-2,5 mm. Yavrunun yaşını veya gerginliğini telafi etmek için derinlik biraz ayarlanabilir.
- Yukarıda açıklanan Nanoject III programını kullanarak hücre süspansiyonunu enjekte edin. Enjeksiyon programı tamamlandıktan sonra, enjeksiyon bölgesinden sıvı sızmasını en aza indirmek için mikropipeti yavaşça geri çekmeden önce 15-20 saniye bekleyin.
- İki taraflı enjeksiyonlar yapıyorsanız, mikropipeti lambdanın üzerine yeniden sıfırlayın ve diğer yarım küredeki uygun koordinatlara geçin. Alternatif olarak, mikropipeti ilk enjeksiyonun 1 mm önüne hareket ettirerek aynı hemisferin korteksine iki enjeksiyon yapılabilir.
- Nakil tamamlandıktan sonra, bandı çıkarın ve yavruyu ısıtma yastığına aktarın. Gerekirse, yavruyu kuyruk veya ayak parmağı kırpma ile etiketleyin. Yavru kırmızı bir renk aldığında ve hareket etmeye başladığında, annesiyle birlikte kafese geri koyun.