Duyusal Akson Rejenerasyonunu Teşvik Etmek için Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Elektroporasyon Aracılı Transfeksiyonu

Özet

Kaynak: Li, Q. et al. Memeli Akson Rejenerasyonunun Araştırılması: Yetişkin Fare Dorsal Kök Ganglionunun İn Vivo Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, akson rejenerasyonunu incelemek için fare DRG nöronlarının elektroporasyon aracılı transfeksiyonunu göstermektedir. Nükleik asit yapılarını DRG nöronlarına iletmek, siyatik sinir hasarını indüklemek ve aksonal rejenerasyonu değerlendirmek için adımları ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Dorsal kök ganglion (DRG) Enjeksiyonu
   1. DRG enjeksiyonundan önce anesteziyi sürdürmek için anestezik bir solüsyon enjekte edin (avertini steril salin içinde 20 mg / mL nihai konsantrasyonda, avertin 200 mg / kg vücut ağırlığı ile seyreltin).
   2. Deoksiribonükleik asit (DNA) plazmitlerini veya ribonükleik asit (RNA) oligolarını (DRG başına 1 μL) cam kılcal pipete yükleyin.
   3. Kılcal cam pipetin ucunu dikkatlice DRG'ye yerleştirin.
   4. Hücre içi mikroenjeksiyon dağıtım sistemlerini (30 psi, 8 ms) kullanarak DRG'ye 1.0 μL'lik DNA plazmidleri veya RNA oligoları çözeltisi kademeli olarak enjekte edin.
      NOT: Enjeksiyon süresi 5 dakikadan az sürmemelidir.
2. Electroporation
   1. Elektrotların uçlarına fosfat tamponlu salin (PBS) damlatın.
   2. Kanamayı sterilize edilmiş kare pamuklu gazlı bezle temizleyin.
   3. Hedef DRG'yi elektrotlarla nazikçe sıkıştırın ve elektroporasyon sistemi ile 5 kare elektrik darbesi uygulayın.
   4. Kas ve cilt tabakalarını sırasıyla 5-0 naylon dikişlerle kapatın.
   5. Fareyi, sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci tamamen geri kazanana kadar yakından dikkat altında ısıtılmış bir battaniyenin (35.0 °C) üzerine yerleştirin. Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
      NOT: Farenin 37 °C battaniye üzerindeki anesteziden tamamen iyileşmesi yaklaşık 60 dakika sürer. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için günlük beslenme için bir hap (200 mg) ibuprofen'i 1.000 ml suya (0.2 mg / ml) çözün.
3. Sciatic Nerve Crush
   1. DRG elektroporasyonundan iki veya üç gün sonra (deneysel tasarıma bağlı olarak), fareyi anestezik solüsyonla (avertin 400 mg / kg vücut ağırlığı ile) intraperitoneal olarak uyuşturun.
   2. Farenin dört uzvunu mantar pano üzerine bantlayın.
   3. Orta hat boyunca sol tarafa 0,5 cm 1 cm'lik bir kesi yapın. Gluteus maximus kası ve piriformis kası gibi kasları uzunlamasına kesin. Siyatik sinirin daha büyük siyatik foramen ve siyatik çentik arasındaki segmentini ortaya çıkarın.
   4. Mikrocerrahi forseps ile siniri 12 saniye boyunca ezin ve ezilme bölgesini 10-0 naylon epinöral sütür ile işaretleyin. Ezilme bölgesini işaretlemek için dural membran üzerinde bir düğüm atın.
   5. Kas ve cilt tabakalarını 5-0 naylon dikiş ile kapatın.
   6. Fareyi, sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci tamamen geri kazanana kadar yakından dikkatli bir şekilde ısıtılmış bir battaniyenin (35.0 °C) üzerine yerleştirin. Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
      NOT: Farenin 37 °C battaniye üzerindeki anesteziden tamamen iyileşmesi yaklaşık 60 dakika sürer. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için günlük beslenme için bir hap (200 mg) ibuprofen'i 1.000 ml suya (0.2 mg / ml) çözün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ECM 830 Kare dalga elektroporasyon sistemi	BTX Harvard Apparatus	45-0052	In vivo elektroporasyon için
Cımbız elektrotları	BTX Harvard Aparatı	45-0524	İn vivo elektroporasyon için, 1 mm düz
Picospritzer III	Parker Enstrümantasyon	1096	Hücre İçi Mikroenjeksiyon Dağıtım Sistemleri
Borosilikat Cam Kılcal Damarlar	World Precision Instruments, Inc.
Stereo Diseksiyon Mikroskobu	Leica	M80
Mikrocerrahi Forseps	FST, DUMONT, İsviçre	11255-20	Sadece siyatik sinir ezilmesi için
Cam Kılcal	Hassas Aletler, Inc.	TW100-4	10 cm, standart duvar
bandı	Fisherbrand	15-901-30	Fareyi mantar pano üzerine sabitlemek için
2, 2, 2-Tribromoetanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stok çözeltisi
2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stok çözeltisi
siRNA Floresan Evrensel Negatif Kontrol #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Floresan mikroRNA ile hedef olmayan siRNA
Dy547 ile Mimik Transfeksiyon Kontrolü	Dharmacon	CP-004500-01-05	Floresan ile hedef olmayan mikroRNA
Plazmid hazırlama kiti	Invitrogen Purelink	K210016	GFP kodlayan plazmit hazırlama
Hızlı Yeşil Boya	Millipore-Sigma	F7252	Enjeksiyon sırasında DRG taslağının daha iyi görselleştirilmesi için
Ketamin	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anestezi indüksiyonu
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anestezi indüksiyonu
Asetaminofen	McNeil Tüketici Sağlığı	NDC 50580-449-36	Ameliyat sonrası ağrı kesici

1902328 Dünya