$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Nöronal Kültür
- Poli-ornitin (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 1/6'ya seyreltilmiş, stok konsantrasyonu% 0.01'e seyreltilmiş) cam lamellerle 6 oyuklu kültür plakalarını gece boyunca (O / N) tedavi edin, ardından DPBS'de üç yıkama yapın. Ardından, akış başlığının altında en az 10 saat boyunca laminin (stok konsantrasyonu 1 mg / ml, DPBS'de 500 kez seyreltilmiş) ekleyin.
- Nöral kök hücreyi (NSC) düşük yoğunlukta (50.000 hücre/cm2) Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortam/Besin Karışımı F-12 veya DMEM/F12 (500 ml), 2 flakon (her biri 5 ml) N2 takviyesi, 2 flakon (her biri 10 ml) B27 takviyesi içeren 3 ml kültür ortamında cam lamelli 6 oyuklu kültür plakalarında plakalayın ve gönderin, 10 ml Pen-Streptomisin (Penisilin = 10.000 birim / ml ve Streptomisin = 10.000 birim / ml), 1 ml 2-merkaptoetanol (Stok çözeltisi: 50 mM) ve laminin (1/500), büyüme faktörleri olmadan.
KRİTİK ADIM: Hücre kümelenmesini azaltmak için yavaş dönen hareketlere sahip hücreler ekleyerek bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. - Kültür ortamını çıkarın. Nöronu cam lamellere bağlı tutmak ve topaklanmayı önlemek için 2 μg / ml taze laminin çözeltisi içeren taze N2B27 ortamı ekleyin. Ortamı her 3 günde bir değiştirin. Hücrenin kurumasını önlemek için taze ortam eklemeden önce kalan ortamın bir kısmını (200 μl) saklayın. Alternatif olarak, hızlı bir şekilde ilerleyin ve toplam hacmi (3 ml) değiştirin.
2. Lentiviral Transdüksiyon
Notu: Yeşil Floresan Protein (GFP) ekspresyonu, fare fosfogliserat kinaz (PGK) promotörü tarafından yönlendirilir. Bu çalışma için viral titre 400 ng/μl idi (fosfat tamponlu salin (PBS) 1x) içinde stok çözeltisi).
- İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre veya iPSC'den türetilmiş nöronları, kültür kuyucuğu başına 40 ng GFP lentiviral vektörü içeren stok çözeltisinden 1 μl ekleyerek viral partiküller tarafından çoğaltın (6 oyuklu plakalar) ve taze kültür ortamında 48 saat inkübe edin. Not: Bu protokol için inkübasyon süresi, omurga yapılarının iyi bir şekilde etiketlenmesine izin verir.
3. İmmünofloresan
Not: Tüm omurga morfolojisinin etiketlenmesini iyileştirmek için, geçirgen koşullarda bir anti-GFP antikoru kullanılarak immünofloresan etiketleme yapıldı.
- Kültür ortamını çıkarın ve transdüksiyonlu hücreleri oda sıcaklığında veya RT'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde lameller üzerine sabitleyin, ardından 1x PBS'de (her biri 10 dakika) 3 kez yıkayın.
- Lamelleri RT'de 1 saat boyunca %0,05 Triton (100x) ve %10 at serumu ile desteklenmiş PBS'ye daldırın, ardından 1x PBS'de 3 kez yıkayın.
- % 4 at serumu ve GFP'ye karşı yükseltilmiş ve her lamel üzerinde 1.000 faktör ile seyreltilmiş primer antikor (1/1.000) ile desteklenmiş 100 μl 1x PBS ekleyin. 4 ° C'de karanlık bir kutu O/N içinde inkübe edin, ardından 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
- Alexa Fluor 488-konjuge antikoru (1/200) %0.5 Tween 20 ile takviye edilmiş PBS'de seyreltin ve RT'de 1 saat inkübe edin. Ardından, 1x PBS'de 3 kez yıkayın ve lamellerin floresan mikroskobu için bir montaj ortamı ile cam slaytlara monte edin.
4. Dendritik Omurga Görüntüleme
:
- Konfokal lazer tarama mikroskobu ile konfokal Görüntüleme gerçekleştirin.
- Piramidal morfolojiye ve tam dendritik arborizasyona sahip sağlıklı nöronları seçin ve ayrı deneylerden koşul başına en az 10 nöron ölçün. Dendrit başına 60 - 100 μm miktarını belirleyin.
- 40X yağ NA = 1.3 objektif ve GFP uyarımı için 488 nm lazer çizgisi kullanarak, numune seviyesinde yaklaşık 20 μW tipik bir tepe gücü ile görüntüler elde edin. Dendritik dikenleri düzgün bir şekilde örneklemek için piksel boyutunu 80 nm civarında ayarlayın.
Not: Sonraki analiz, gürültünün dendritlerin ve dikenlerin uygun segmentasyonunu tehlikeye atmadığı bir görüntü gerektirir. Yukarıda bahsedilen uzamsal örnekleme ve güç ayarlarıyla, böyle bir görüntü oluşturmak için yeterli foton toplamak için 3,15 μs'lik bir piksel bekleme süresinin yeterli olduğunu gözlemledik. Loş örnekler için, ortalama 2 ila 4 tarama ile görüntü kalitesi iyileştirilebilir. İlgilenilen bölgeyi kaplamak için birkaç XY karosunun satın alınması gerekebilir, bu daha sonra işlenmeden önce birbirine dikilmesi gerekir. - Tüm nöron hacmini örneklemek için, 150 nm ila 300 nm arasında değişen bir Z aralığına sahip bir Z yığını elde edin ve 20 ila 30 Z dilimi elde edin.
Not: Bu ayarlarla elde edilen yanal uzamsal çözünürlük 234 nm'dir ve eksenel çözünürlük 591 nm'dir. Burada seçilen örnekleme yeterlidir, ancak eksenel çözünürlük, görüntülenecek dikenlerin en küçük boyutundan daha büyük olduğundan, analiz, dendritlerden yanal olarak uzanan dikenleri tercih eder.
5. 3D Dendritik Dikenlerin Miktar Tayini
Not: Aşağıdaki bölümlerde özellikle analiz için Imaris yazılımının kullanımı açıklanmaktadır. Benzer sonuçlar sağlayabilen NeuronStudio veya Metamorph dahil olmak üzere alternatif uygulamalar mevcuttur.
Aşağıdaki temel ayarları kullanın:
- Ön işleme aşaması olarak, yazılım tarafından sunulan görüntü işleme olanakları aracılığıyla Gauss filtrelemesi kullanılır. Görüntü İşleme > Yumuşatma > Gauss Filtresi aracılığıyla Gauss filtrelemesi gerçekleştirin. Filtre genişliğini XY cinsinden piksel boyutuna eşit olacak şekilde ayarlayın.
- Yazılımın Filament Tracer modülünü kullanarak dendritlerin Yarı otomatik izlemesini gerçekleştirin.
- İlk olarak, yazılımın Dilim sekmesindeki uzaklık aracını kullanarak dendrit çapını tahmin edin.
- Aşma sekmesinde, Filamentler aracına tıklayın. Daha iyi bir sağlamlık için bu protokol yarı otomatik izlemeye dayanır; Otomatik oluşturmayı atla'ya tıklayın. Modül arayüzü şimdi Çiz sekmesini gösteriyor. Burada, yöntem olarak AutoPath'i, tür olarak Dendrit'i seçin ve tahmini dendrit çapını girin.
- İmleci bir kutuya çevirerek işaretçinin Seç modunu kullanın. Dendrit başlangıç noktasına Shift tuşunu sağ basarak tıklayın. Not: Yazılım ilk hesaplamaları yapar.
- İşaretçiyi dendrit boyunca hareket ettirin. Başlangıç noktasından (mavi küre olarak temsil edilir), en olası dendrit yolunu temsil eden sarı bir çizgi gösterilir. Shift tuşunu basılı tutarak dendrit uç noktasına sol tıklayın.
- Otomatik diken segmentasyonunu gerçekleştirin. Not: İzlenen dendrit üzerindeki dikenler, modül arayüzü tarafından otomatik olarak bulunacaktır.
- Modül arayüzünde, Oluşturma sekmesine tıklayın. Yeniden Oluştur açılır listesinde, Dendrit Çapını Yeniden Oluştur'u seçin ve Verileri koru kutusunu işaretleyin. Ardından Yeniden Oluştur'u tıklayın.
- Eşiği, segmentli hacim gerçek dendrit hacmine karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Algoritma olarak, Mesafe Haritasından En Kısa Mesafeyi seçin. İleri düğmesine tıklayın.
- Yine yazılımın Dilim sekmesindeki mesafe aracını kullanarak en küçük omurga başı çapını ve maksimum uzunluğu belirleyin, ardından Aşma sekmesine geri dönün ve parametreleri girin. Bu protokol için minimum çap için 200 - 300 nm ve maksimum uzunluk için 4 μm civarındaki değerler iyi başlangıç noktalarıdır. Dal Dikenlerine İzin Ver kutusunu işaretlemeyin. İleri düğmesine tıklayın.
- Tohum Noktaları Eşiğini, dikenleri temsil eden mavi noktalar gerçek omurga başlarına lokalize olacak şekilde ayarlayın. İleri düğmesine tıklayın. Not: Çekirdek hesaplama şimdi yapılmıştır ve uzun sürebilir.
- Modül arayüzünün Araçlar sekmesine giderek dikenleri sınıflandırın. Dikenleri Sınıflandır'a tıklayın. İstenen kullanıcı arabiriminde, morfolojilerine göre aşağıdaki gibi tanımlanan dört sınıf olduğundan emin olun: Güdük: uzunluk <1 μm; Mantar: Uzunluk (omurga) >3 ve Maksimum genişlik (baş) >ortalama genişlik (boyun) x 2; Uzun ince: Ortalama genişlik (baş) ≥ Ortalama genişlik (boyun); Filopodia benzeri: Uzunluk ≤ 4 μm (kafa yok). Not: Modül arayüzü, sınıflandırmanın sonuçlarını içeren dört yeni Filament nesnesi oluşturur.
- İstatistiksel verileri dışa aktar: Bu dört nesne arayüzünden herhangi birinde, İstatistikler sekmesine gidin. Tüm İstatistikleri Dosyaya Aktar düğmesine tıklayın.
Not: Dendritler (örn. uzunluk, alan, ortalama çap, dal derinliği, dallanma açısı, hacim vb.) ve dikenler (örn. düzlük, bağlanma alanı, farklı omurga parçalarının uzunluğu ve hacmi, omurga çapı, yoğunlukları vb.).