Merkezi Sinir Sistemi Hastalıklarının Tedavisi için Bir Fare Modelinde Virüslerin İntratekal Verilmesi

Özet

Kaynak: Li, D., et al. Yetişkin Farelerde Rekombinant Adeno İlişkili Virüslerin Doğrudan İntratekal Enjeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, adeno-ilişkili virüslerin (AAV) uyanık bir farenin beyin omurilik sıvısına (BOS) intratekal enjeksiyonu için şırınga hazırlığı, omurga hizalaması ve hassas iğne yerleştirmeyi kapsayan prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, CNS tedavileri için potansiyelini destekleyerek hedeflenen gen iletimini doğrular.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1.% 20 Lidokain Hidroklorür Stok Çözeltisinin Hazırlanması

1. 2 g lidokain hidroklorür tartın. 5-6 mL steril su ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Steril su ile hacmi 10 mL'ye yükseltin.
2. 1.2 Stok çözeltisini 0,2 mikronluk filtrelerden süzün. Stok çözeltisini, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü başına 1 mL'yi ayırın ve bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. 4 °C'de saklayın.

2. Uyanık Farelerde Doğrudan İntratekal AAV Teslimatı

1. Çalışma alanını %70 etanol içeren steril gazlı bez kullanarak silin ve gerekli malzemeleri hazırlayın.
2. Steril bir 200 μL mikrosantrifüj tüpüne 95 μL rAAVrh10 stok çözeltisi (5 x 10¹² genom kopyası / mL) ekleyerek 100 μL AAVrh.10/%1 lidokain hidroklorür kompleksi hazırlayın ve 5 μL %20 lidokain hidroklorür stok çözeltisi ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra virüs solüsyonunu buz üzerinde (4 °C) saklayın.
   NOT: Fare başına 8 μL kullanılacaktır.
3. Aviv solüsyonlu şırınganın enjeksiyon için hazırlanması
   1. 25 μL'lik bir Hamilton şırıngasını 27 G'lık bir iğne ile birleştirin ve iğnenin eğimli ucunu şırınga üzerindeki hacimsel ölçekle hizalayın.
   2. Virüs çözeltisinin 4 x 10¹⁰ genom kopyası ile 8 μL'yi şırıngaya nazikçe çizin. Hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun.
4. Farenin hazırlanması
   NOT: Bu çalışmada erkek veya dişi FVB/NJ fareleri (30-70 günlük) kullanılmıştır. Davlumbazda IT enjeksiyonu yapıldı.
   1. Çalışma alanını %70 etanol ile bir davlumbazda sterilize edin. Uyanık fareyi (erkek veya dişi, 30-70 günlük, 13-20 g ağırlıkta) kapüşonda yüzüstü pozisyonda bir yatak örtüsünün üzerine koyun. Fareyi sakinleştirmek ve ısırılmasını önlemek için üst gövdeyi steril gazlı bezle örtün.
   2. Hayvanı, bir tarafta başparmak ve diğer tarafta işaret parmağı/orta parmak ile pelvik kuşağını uygun ve sıkı bir şekilde kavrayarak sabitleyin. Bilateral pelvik kuşaklar arasındaki cildi başparmak ve işaret parmağı ile gergin tutun. Avuç içi ile hayvanın üst gövdesine nazikçe tutun.
   3. Kürkü iki taraflı pelvik kuşaklar arasında sırt üstü tıraş edin, ardından cilt yüzeyini iyodür bazlı bir ovma ve% 70 etanol ile sterilize edin.
5. Intrathecal Injection
   1. Diğer elinizin başparmağı veya işaret parmağı ile bilateral pelvik kuşaklar arasındaki orta çizgi boyunca intervertebral boşluğu hissedin ve L5-L6 intervertebral boşluğu belirtmek için tırnağınızla bir girintiye basın (enjeksiyon bölgesini bulun).
   2. Omurganın orta çizgisini belirtmek için kuyruğun tabanını hafifçe ve nazikçe döndürün. Enjeksiyondan önce iğne eğimini hayvanın kafasına doğru ayarlayın.
   3. Hayvanların sıkıca sabitlendiğinden emin olun ve iğneyi omurganın orta hattı boyunca hizalayın.
   4. Şırıngayı merkezi bir sagital düzlemde tutarak iğneyi girintinin kesişme noktasına nazikçe ve dikey olarak yerleştirin (veya hafifçe 70-80° eğin). Kemiği birbirine bağladığında açıyı yavaşça yaklaşık 30°'ye düşürün, ardından iğneyi intervertebral boşluğa kaydırın.
      NOT: Belirgin bir ani kuyruk hareketi, intradural boşluğa başarılı bir girişin işaretidir. İğne intervertebral boşluğa girdiğinde, iğne ucu sıkıca kenetlenmiş hissedecektir. Bu çalışmada kullanılan 27 G iğne, farelerde BT uygulaması için uygundur, ancak sıçanlarda uygun değildir.
   5. Vektör çözeltisini enjekte edin. Zamanlayıcıyı başlatın ve 1 μL/4 s hızında 8 μL vektör çözeltisi enjekte edin. Teslimatı bitirdikten yaklaşık 1 dakika sonra iğneyi tutun. Sızıntıyı önlemek için iğneyi hafifçe döndürerek geri çekin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
FVB/NJ fareleri	Charles River Laboratories Çin
Lidokain hidroklorür monohidrat	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vektör Çekirdeği Üniversitesi Gen Terapi Merkezi Massachusetts Tıp Okulu
25μL Hamilton şırınga / 27-30g iğne	GASTIGHT	1702
70 Etanol	WEN ZHI
Gazlı Bez	Wei AN 5171112		8cm * 10cm * 12cm

%