Kültürlü Astrositlerde Yükün Hücre İçi Taşınımının Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Creighton, BA, et al. Astrositlerde organellerin ve diğer kargoların hücre içi taşınımını görselleştirmek ve analiz etmek. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, asidik endolizozomal vezikülleri seçici olarak etiketleyen bir floresan asidotropik prob kullanılarak kültürlenmiş astrositlerde hücre içi kargo taşımacılığının görselleştirilmesini göstermektedir. Hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskop ile Z-yığını alımı, floresan etiketli kargonun üç boyutlu hücre hacmi boyunca izlenmesine olanak tanır. Analiz, sabit kargoyu hücre çevresine veya çekirdeğe doğru hareket eden kargodan ayırarak hücre içi taşıma dinamikleri hakkında bilgi sağlar.

Protokol

1. Floresan etiketli plazmitlerin transfeksiyonu

1. Transfeksiyon veya etiketlemeden bir gün önce, transfeksiyondan 24-48 saat sonra görüntüleme için istenen yoğunlukta tohum astrositleri. 24 oyuklu plakalar veya 14 mm cam tabanlı kuyucuklar için önerilen yoğunluk 2 x 104 hücre/kuyudur.
   NOT: Bu protokol, 24 oyuklu plakalar veya 14 mm cam tabanlı kuyular üzerinde 12 mm cam lameller üzerine kaplanmış astrositlerin lipofeksiyon bazlı bir yöntem kullanılarak transfeksiyonu için optimize edilmiştir. Reaktifler, astrositlerin büyüdüğü kültür kabının boyutuna bağlı olarak ölçeklendirilmelidir.
2. Lipofeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosu) azaltılmış serum ortamında (Malzeme Tablosu) seyreltin. Lipofeksiyon reaktifinin DNA'ya oranını optimize etmek için, bir dizi yeterli seyreltmeyi test edin. Örneğin, bu protokolde kullanılan reaktif kullanılıyorsa (Malzeme Tablosu), 2, 3, 4 ve 5 μL lipofeksiyon reaktifini 50 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin.
3. 5 μg yüksek saflıkta DNA'yı 250 μL indirgenmiş serum ortamında seyreltin. 5 μL lipofeksiyon arttırıcı reaktif ekleyin (Malzeme Tablosu). Lipofeksiyon reaktifini içeren tüpü eşit hacimde DNA-lipofeksiyon arttırıcı karışımı ile birleştirin. Pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
4. Astrosit kültür ortamını çıkarın ve hücrelere damla damla transfeksiyon karışımı (adım 1.3) ekleyin. 37 ° C ve% 5 CO2'de 6 saatlik bir inkübasyondan sonra, transfeksiyon kompleksini uygun hacimde astrosit kültür ortamı (14 mm cam tabanlı tabaklar için 2 mL) ile değiştirin. Görüntü alımına devam etmeden önce 24-72 saat daha inkübe edin. Protein ekspresyonu ve hücre canlılığı arasında en iyi dengeyi sağlamak için inkübasyon adımının süresini yakından izleyin.

2. Floresan problar kullanılarak geç endozomların / lizozomların etiketlenmesi

NOT: Bazı kargolar, kargoya özgü proteinler için yüksek afiniteye sahip floresan boyalar kullanılarak etiketlenebilir. Aşağıdaki örnek, geç endozomların/lizozomların bir floresan asidotropik prob ile etiketlenmesine izin verir.

1. Lizozomal etiketleme probunu (Malzeme Tablosu) 200 μL astrosit kültür ortamında 1 μM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve 2 x 104 hücre / kuyu yoğunluğunda adım 1.1'den astrositlere uygulayın. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
2. Hücreleri bir kez ılık astrosit kültür ortamı ile yıkayın ve görüntüleme ortamı ile değiştirin (Malzeme Tablosu). Hemen canlı görüntülemeye devam edin.

3. Hızlandırılmış görüntüleme sistemi kullanarak görüntü elde

etme

NOT: Hızlandırılmış canlı görüntüleme, yüksek hızlı bir kamera, belirli odak, inkübasyon odası ve yüksek sayısal açıklığa sahip 40x yağ objektifi ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak yapılmalıdır (örneğin, Plan-Apochromat 1.4NA). Hızlandırılmış görüntüleme için çeşitli edinim yazılımları mevcuttur. Mikroskopi sisteminin ve edinim yazılımının seçimi, bunların mevcudiyetine ve belirli bir çalışmanın hedeflerine uygunluğuna dayanmalıdır. Bazı genel yönergeler aşağıda verilmiştir.

1. Kültür haznesini veya kabını mikroskop tablasındaki uygun adaptöre yerleştirin. Epifloresan ışığı kullanarak, floresan proteinleri ifade eden hücreleri veya kaydetmek için prob seçin. Dijital kamerayı kullanarak seçilen hücre(ler)i görselleştirmek için floresan örnek aydınlatmasını ayarlayın. Foto ağartma ve fototoksisiteye neden olabilecek yüksek aydınlatma kullanmaktan kaçının. Odağı ve yakınlaştırmayı ayarlayın.
2. Yakınlaştırma ve kesin odak işlevlerini kullanarak 300 sn ile 500 sn arasında değişen zaman aralıkları için her 2 karede 1 kare frekansında tek Z-yığını zaman atlamalı serisi elde edin.
   NOT: Trafik dinamikleri (hız, hareket frekansı vb.) ilgilenilen proteine bağlı olarak değişecektir, bu nedenle edinim zaman seyrinin ayarlanması gerekebilir. Örneğin, mitokondri lizozomlardan daha az hareketlidir ve sık sık duraklamalar sergiler. Bu durumda, alım parametrelerini 800 s boyunca her 5 saniyede bir 1 kareye ayarlamak daha uygundur.
3. Zaman atlamalı görüntüleri kaydedin ve bunları AVI veya TIFF yığın dosyaları olarak dışa aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Sığır Serumu	İkizler	100-106	Isıyla Etkisiz
FIJI (Fiji Sadece Görüntü J)	NIH	Sürüm 1.52i
İnce Uçlu Cımbız	FST	11254-20	Stil #5
Floresan ışık kaynağı	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Cam Alt Tabaklar	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Çanak | No. 1.5 Lamel | 14 mm Cam Çapı | Kaplamasız
Graefe Forseps	FST	11054-10	Graefe Iris Forseps Kavisli uçlu
Yeşil floresan boya, asidik bölmeleri lekeleyen yeşil floresan boya (geç endozomlar ve lizozomlar)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. DMSOS içinde 1mM'lik bir stok çözeltisine önceden çözülür. Büyüme ortamındaki veya tercih edilen tampondaki nihai çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (10x)	Gibco	14065-056	Magnezyum ve kalsiyum içermez
Görüntüleme Ortamı	Yaşam Teknolojileri	A14291DJ	Canlı Hücre Görüntüleme Çözümü
Ters Konfokal Mikroskop	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofeksiyon Arttırıcı Reaktif	Yaşam Teknolojileri	11514015	Plus
Reaktif Lipofeksiyon Reaktifi	Yaşam Teknolojileri	15338100	Lipofektamin LTX reaktifi
Orbital sallama inkübatörü	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230, sıcaklık ve hız kontrollü orbital sallama inkübatörü
Penisilin / Strepomisin çözeltisi (100x)	Gen Klonu	25-512
Fosfat Tamponlu Salin (10x)	Gen Klonu	25-507x
Poli-D-Lizin Hidrobromür	Sigma	P7405	Tris tamponunda, pH 8.5, 1mg / mL'de çözülür. Uzun süreli depolama için dondurun. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının
Azaltılmış serum ortamı	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Doku Kültürü Şişeleri	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. % 100 açılı boyun erişimi, 0.22um hidrofobik havalandırmalı filtre kapağı
Doku kültürü inkübatörü	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, sıcaklık, nem ve CO2 kontrollü
doku kültürü inkübatörüTris-Base	Sigma	T1503	8.402 g 4.829 g Tris HCl ile suda bir litreye çözülerek 0.1 M Tris tamponu yapılır, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g 8.402 g Tris Baz ile suda bir litreye çözülür 0.1 M Tris tamponu yapmak için, pH 8.5