Bu video, asidik endolizozomal vezikülleri seçici olarak etiketleyen bir floresan asidotropik prob kullanılarak kültürlenmiş astrositlerde hücre içi kargo taşımacılığının görselleştirilmesini göstermektedir. Hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskop ile Z-yığını alımı, floresan etiketli kargonun üç boyutlu hücre hacmi boyunca izlenmesine olanak tanır. Analiz, sabit kargoyu hücre çevresine veya çekirdeğe doğru hareket eden kargodan ayırarak hücre içi taşıma dinamikleri hakkında bilgi sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kültürlü Astrositlerde Yükün Hücre İçi Taşınımının Görselleştirilmesi
650 görüntülenme
⸱
17 Haziran 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Floresan etiketli plazmitlerin transfeksiyonu
- Transfeksiyon veya etiketlemeden bir gün önce, transfeksiyondan 24-48 saat sonra görüntüleme için istenen yoğunlukta tohum astrositleri. 24 oyuklu plakalar veya 14 mm cam tabanlı kuyucuklar için önerilen yoğunluk 2 x 104 hücre/kuyudur.
NOT: Bu protokol, 24 oyuklu plakalar veya 14 mm cam tabanlı kuyular üzerinde 12 mm cam lameller üzerine kaplanmış astrositlerin lipofeksiyon bazlı bir yöntem kullanılarak transfeksiyonu için optimize edilmiştir. Reaktifler, astrositlerin büyüdüğü kültür kabının boyutuna bağlı olarak ölçeklendirilmelidir. - Lipofeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Sığır Serumu | İkizler | 100-106 | Isıyla Etkisiz |
| FIJI (Fiji Sadece Görüntü J) | NIH | Sürüm 1.52i | |
| İnce Uçlu Cımbız | FST | 11254-20 | Stil #5 |
| Floresan ışık kaynağı | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| Cam Alt Tabaklar | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Çanak | No. 1.5 Lamel | 14 mm Cam Çapı | Kaplamasız |
| Graefe Forseps | FST | 11054-10 | Graefe Iris Forseps Kavisli uçlu |
| Yeşil floresan boya, asidik bölmeleri lekeleyen yeşil floresan boya (geç endozomlar ve lizozomlar) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. DMSOS içinde 1mM'lik bir stok çözeltisine önceden çözülür. Büyüme ortamındaki veya tercih edilen tampondaki nihai çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin. |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnezyum ve kalsiyum içermez |
| Görüntüleme Ortamı | Yaşam Teknolojileri | A14291DJ | Canlı Hücre Görüntüleme Çözümü |
| Ters Konfokal Mikroskop | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofeksiyon Arttırıcı Reaktif | Yaşam Teknolojileri | 11514015 | Plus |
| Reaktif Lipofeksiyon Reaktifi | Yaşam Teknolojileri | 15338100 | Lipofektamin LTX reaktifi |
| Orbital sallama inkübatörü | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230, sıcaklık ve hız kontrollü orbital sallama inkübatörü |
| Penisilin / Strepomisin çözeltisi (100x) | Gen Klonu | 25-512 | |
| Fosfat Tamponlu Salin (10x) | Gen Klonu | 25-507x | |
| Poli-D-Lizin Hidrobromür | Sigma | P7405 | Tris tamponunda, pH 8.5, 1mg / mL'de çözülür. Uzun süreli depolama için dondurun. Donma ve çözülme döngülerinden kaçının |
| Azaltılmış serum ortamı | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Doku Kültürü Şişeleri | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. % 100 açılı boyun erişimi, 0.22um hidrofobik havalandırmalı filtre kapağı |
| Doku kültürü inkübatörü | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, sıcaklık, nem ve CO2 kontrollü |
| doku kültürü inkübatörüTris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g 4.829 g Tris HCl ile suda bir litreye çözülerek 0.1 M Tris tamponu yapılır, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g 8.402 g Tris Baz ile suda bir litreye çözülür 0.1 M Tris tamponu yapmak için, pH 8.5 |
