Bir fare beyni bölümündeki kan-beyin bariyerinin yüksek çözünürlüklü üç boyutlu konfokal görüntülemesi

Özet

Kaynak: Villaseñor, R ve Collin. L. Kan-beyin Bariyerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Görüntülemesi: Görüntüleme, 3D Rekonstrüksiyon ve Transsitozun Niceliklendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, beyin homeostazı, nörovasküler etkileşimler ve hastalıkla ilişkili BBB disfonksiyonunu incelemek için geçerli olan BBB bileşenlerini ve hücre içi yapıları analiz etmek için antikor lekeli fare beyin bölümlerini gösteren, konfokal mikroskopi kullanılarak kan-beyin bariyerinin (BBB) yüksek çözünürlüklü 3D görüntülemesini göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Kan-beyin Bariyerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Görüntülemesi
2. Işık spektrumunun mavi, yeşil, turuncu ve kırmızı bölgelerindeki floroforların uyarılması için 405, 488, 561 ve 633 nm'de lazer çizgileri ile uygun bir lazer taramalı konfokal mikroskopla (Malzeme Tablosuna bakınız) görüntü elde edin. Görüntü elde etmek için, sayısal açıklığı 1,4 olan bir 63X yağ objektifi kullanın.
3. Mikroskobu kontrol eden yazılımın toplama menüsünde, görüntü elde etme parametrelerini ayarlayın. "Görsel boyutu" açılır menüsünde 1024 x 1024 piksellik bir değer seçin. 'Zoom' menüsünün değerini ayarlayarak piksel boyutunu 200 ile 300 nm arasında bir değere değiştirin."
   NOT: Hücre içi yapıların analizi için piksel boyutunu 75 nm'ye düşürün. Bu görüntü boyutu ayarı, çekim süresini önemli ölçüde artırır ve daha küçük bir görüş alanı görüntüleyerek çekim süresini azaltmak için 512 x 512 piksele düşürülebilir.
4. 'Edinme Hızı' açılır menüsünde 400 Hz, yani saniyede 400 satırlık bir değer seçin. 'Sistem ayarları' menüsünde, 'Piksel derinliği' açılır menüsünü seçin ve değeri 12 bit olarak değiştirin.
5. Mikroskop yazılımında, 'edinim' sekmesinde, sıralı çerçeve alımı seçeneğini açın. 'İğne Deliği' menüsündeki değeri değiştirerek optik kesit kalınlığını her kanal için 0,75 ile 1 μm arasında bir değere ayarlayın.
6. Floresan uyarma panelinde, numunedeki floroforları en iyi şekilde uyarmak için gereken lazeri etkinleştirin, örneğinample, yeşil yayan bir florofor için 488 nm'lik bir lazer çizgisi.
   NOT: Uygun uyarma lazerini seçmek için bir florofor spektrumu görüntüleyici (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
7. Floresan algılama panelinde, her kanalda ölçülecek dalga boylarını seçmek için kaydırıcıyı hareket ettirin, örneğinample, yeşil yayan bir florofor için 510 ile 550 nm arasında.
   NOT: Yeterli algılama dalga boylarını seçmek için bir florofor spektrumu görüntüleyici (Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
Cam lamel
8. ve objektifin kırılma indisini eşleştirmek için beyin bölümü ile lamel üzerine kırılma indisi 1.52 olan bir damla daldırma yağı ekleyin. Numuneyi mikroskoba yerleştirin ve mikroskop dürbününü kullanarak numuneyi görselleştirmek için epifloresan lambayı açın.
9. Mikroskop standındaki düğmeleri kullanarak, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) lekeli çekirdekleri görselleştirmek için uygun bir filtre seçmek için filtre tekerleğini değiştirin. DAPI lekeli çekirdeklerden gelen sinyali odağa getirmek için kaba odağı kullanın.
10. Mikroskop standındaki düğmeleri kullanarak, vasküler belirteçlerden (örneğin, CollagenIV veya CD31) gelen sinyali görselleştirmek için filtreleri değiştirin ve görüş alanını tek bir kılcal segment üzerinde ortalayın.
11. Canlı tarama modunu başlatmak için düğmesine basın. Tarama sırasında, görüntülerin dinamik aralığını en üst düzeye çıkarmak ve piksel doygunluğunu önlemek için her kanal için kazancı ve lazer yoğunluğunu ayarlayın.
    NOT: Aşırı doygunluğu görsel olarak değerlendirmek için doygun pikselleri etiketleyen bir arama tablosu kullanın. Sinyalin aşırı doygunluğunu önlemek için, en yüksek floresan sinyaline sahip olması beklenen örnekle ayarları yapın.
12. Satır ortalaması değerini 2,
    olarak ayarlayınNOT: Daha yüksek alım hızları kullanırken, gürültüyü azaltmak için bu değeri artırın.
13. Kılcal damarın tüm hacmini kaplayan optik z-yığınlarını gerçekleştirmek için başlangıç ve bitiş bölümleri oluşturun. 0,45 μm.
    NOT: Görüntüler sonraki niceleme için kullanılacaksa, tüm veri seti için aynı çekim ayarlarını koruyun.
14. Miktar tayini için, istatistiksel karşılaştırmalar için en az üç farklı fareden bölüm başına 10 ila 20 z-yığını elde edin.
    NOT: Numune ağartma ve lazer yoğunluğu dalgalanmalarından kaynaklanan değişkenliği azaltmak için aynı oturumda tam veri setini elde edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CD31/PECAM'a karşı sıçan monoklonal antikor klonu ER-MP12	Novus Biologicals	MCA2388	Etiketleri Beyin Endotel Hücreleri Seyreltmede kullanın 1:100 seyreltmede kullanılan uygun AlexaFluor boyası ile birleştirilmiş eşek poliklonal sıçan önleyici IgG (H + L) ile tespit edin
Podokaliksin'e karşı sıçan monoklonal antikoru	Ar-Ge Sistemleri	MAB1556	Etiketler Kılcal damarların lümeniSeyreltmede kullanın 1:100 eşek poliklonal sıçan önleyici IgG (H + L) ile birlikte uygun AlexaFluor boyası ile birlikte, seyreltmede kullanılan 1:400
CollagenIV'e karşı tavşan poliklonal antikoru	Biotrend	BT21-5014-70	Etiketler Kılcal damarların bazal zarıSeyreltmede kullanın 1:100 eşek poliklonal tavşan önleyici IgG (H + L) ile birlikte uygun AlexaFluor boyası ile birleştiğinde, seyreltmede kullanılan 1:400
Ar-Ge Sistemlerine	karşı keçi poliklonal antikoru	AF2335	Etiketler perisitlerSeyreltmede kullanın 1:100 seyreltmede kullanılan uygun AlexaFluor boya ile birleştirilmiş eşek poliklonal anti-keçi IgG (H + L) ile tespit edin 1:400
seyreltmede kullanılırCy3 Abcam ab49874 ile birleştirilmiş GFAP'ye karşı fare monoklonal antikor klonu G-A-5			Etiketler AstrositlerSeyreltmede kullanın 1:100
Iba-1'e karşı tavşan poliklonal antikoru	Wako	019-19741	Etiketler MikrogliaSeyreltmede kullanın 1:100 eşek poliklonal anti-sıçan IgG (H + L) ile tespit edin, seyreltmede kullanılan uygun AlexaFluor boyası ile birleştirilmiş 1:400
Sıçan monoklonal antikoru ABL93 kazanç LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Etiketler LizozomlarSeyreltmede kullanım 1:100 eşek poliklonal sıçan önleyici IgG (H+L) ile birlikte uygun AlexaFluor boyası ile birleştiğinde, seyreltmede kullanılan 1:400
Fare IgG'ye karşı eşek poliklonal antikoru (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Seyreltmede kullanım 1:400
Fare IgG'ye karşı eşek poliklonal antikoru (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Seyreltmede kullanım 1:400
Fare IgG'ye (H+L) karşı keçi poliklonal antikoru AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Seyreltmede kullanım 1:400
Floresan Montaj ortamı	Dako	S3023	Dako floresan montaj ortamı
Lazer Tarama Konfokal mikroskop	Leica Microsystems	NA	HyD dedektörleri ve Beyaz ışık lazeri ile Leica TCS SP8 X
Görüntü işleme yazılımı	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF sürüm 3.1.0 build 8587
Görüntü analiz yazılımı	Bitplane bilimsel yazılım	NA	Imaris sürüm 7.6.5 x64 Fluorescence
SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

CD13 için yapı 31770