Bir Fare Modelinde Viral Vektörlerin Retina Pigment Epiteline Subretinal Enjeksiyonu

Bu makalede

Özet

Kaynak: Park, S. W., et al. Farelerde Gen Tedavisi için Viral Vektörlerin Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyonu Retinal Pigment Epiteli. J. Vis. Uzm. (2015)

Video, bir fare modelinde viral vektörlerin retina pigment epiteline (RPE) subretinal enjeksiyonu için yöntemi açıklamaktadır. Anestezi ve göz hazırlığından hassas lentiviral vektör dağıtımına kadar prosedürü detaylandırarak RPE'de gen entegrasyonunu ve ekspresyonunu sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Enjeksiyon Kiti ve Viral Vektörlerin Hazırlanması

: Etilen oksit gazı kullanılarak sterilize edilmiş 33 G künt iğne ile donatılmış mikrolitre şırıngayı hazırlayın. Mikrotüpte yeterli titre için viral vektörleri PBS'de (Fosfat tamponlu salin) seyreltin (ör., 1 x 10⁶ TU / μl). Şırıngadaki ölü alanı gidermek için şırıngayı viral vektörlerle birkaç kez yıkayın.

2. Viral Vektörlerin Subretinal Enjeksiyonu

Yetişkin fareleri (ör. 6-8 haftalık) tiletamin ve zolazepam (1: 1, 2.25 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (0.7 mg / kg vücut ağırlığı) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezik hale getirin veya alternatif bir uygun anestezi rejimi.
Öğrencileri bir göz damlası fenilefrin %0.5 ve tropikalamid %0.5 ile genişletin.
Mikrolitre şırıngayı 1.5 - 2 μl viral vektör yükleyerek hazırlayın.
Göz kapağını açın ve uygun enjeksiyon için ekvatoru ortaya çıkarmak için gözü çıkıntılı hale getirin. Ameliyat mikroskobu altında ona odaklanın. Enjeksiyonu bitirene kadar çıkıntılı göz pozisyonunu koruyun, aksi takdirde enjeksiyon sırasında iğnenin yer değiştirmesi meydana gelebilir. Göz küresini sıkıca tutmak için parmaklarınızı yörünge kenarının dışına yerleştirin.
Kornea yüzeyine bir damla oftalmik viskoelastik solüsyon uygulayın.
Retinayı görselleştirmek için korneanın üstüne küçük bir yuvarlak kapak sürgüsü yerleştirin.
Daha fazla subretinal enjeksiyon için steril bir 30 G 1/2 iğne kullanarak limbusun hafif arkasında küçük bir delik açın. Kolaylık sağlamak için, deliği sağ göz için daha düşük ve sol göz için daha üstün yapın.
NOT: Delik temporal veya burundan yapılmışsa, enjeksiyondan sonra göz kapağı tarafından kapatılması zordur. İlk ponksiyon, limbus boyunca uzanan ve kolayca tanınabilen limbal damarlardan kaçınmak için limbusun biraz arkasından yapılmalıdır. İlk delme işlemini yaparken lense iğne ile vurmamaya dikkat edin. Lensin delinmesini önlemek için iğnenin tüm eğimini sokmayın.
Mikrolitre şırınganın 33 G künt iğnesini önceden delinmiş delikten geçirin ve hafif direnç hissedilene kadar iğneyi subretinal boşluğa yaklaştırın.
NOT: Subretinal enjeksiyon için, iğnenin en iyi yaklaşma açısı iris düzlemine karşı yaklaşık 45 derecedir ve künt iğne peripapiller alana doğru arkaya doğru itilmelidir. Noktalı kare, Şekil 1'de subretinal enjeksiyon için vitreus boşluğu boyunca önerilen iğne yolunu göstermektedir.
NOT: Retina katmanları çok yumuşak olduğu için delinirken (veya geçerken) herhangi bir direnç hissedilmeyecektir. Bu nedenle, ilk hafif direnç hissi, iğnenin zaten RPE (Retina pigment epiteli) tabakasına temas ettiğini ve iğnenin batırılmasının durdurulması gerektiğini gösterir. Skleral dokuya aşırı basınçla nüfuz etmemeye dikkat edin çünkü iğne potansiyel subretinal boşluğa yerleştirilmelidir. İğne skleral dokuyu aşırı güçle delerse, direnç göstermeden ekstraoküler orbital boşluklara girer. (Bu adım kritiktir)
İstenmeyen doku hasarını önlemek için viral vektörleri (örn. 1 x 10⁶TU / μl) titreme olmadan subretinal boşluğa nazikçe enjekte edin. Ardından iğneyi yavaşça çekin. Enjeksiyon sırasında göz küresini 2.4'te açıklandığı gibi sıkıca tutun.
Retina kanaması olmadığından emin olmak için enjeksiyondan sonra ameliyat mikroskobu altında subretinal bleblerin oluşumunu gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1. Subretinal enjeksiyonun şematik diyagramı. H&E (Hematoksilen ve Eozin boyama), fare gözünün lekeli kesiti, subretinal enjeksiyon için işaretlenmiş bir iğne yolu ile yapıları gösterir (noktalı bir kare). Büyütme:40X, Ölçek çubuğu...