$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücrelerin Tetrametilrodamin etil ester perklorat (TMRE) ile yüklenmesi
NOT: Bu protokolde TMRE, 20 nM'lik bir nihai konsantrasyonda söndürme modunda kullanılır. Genel olarak, tercih edilen mikroskopta hala yeterli sinyal yoğunluğunu sağlayan mümkün olan en düşük TMRE konsantrasyonu kullanılmalıdır. Eşit olmayan buharlaşma nedeniyle, farklı kuyulardaki ortamın hacmi uzun vadeli birincil kültürlerde farklılık gösterebilir. Tüm kuyucuklarda tutarlı TMRE konsantrasyonu sağlamak için, TMRE'yi doğrudan kuyucuklara eklemeyin. Bunun yerine, her bir oyuktaki ortamı aynı miktarda TMRE içeren ortamla değiştirin. Aşağıdaki protokol, kuyucuk başına ~ 1 mL ortam içeren 24 oyuklu plakalardaki birincil nöronlar için tasarlanmıştır.
- Bir doku kültürü laminer akış başlığında çalışarak, her oyuktan 500 μL ortamı tek bir konik tüpe toplayın.
- Oyuk başına, konik tüpe 0,5 μL 20 μM TMRE stoğu ekleyin (örneğin, 24 kuyucuk için 12 μL).
- Kalan ortamı ilk oyuktan dikkatlice aspire edin ve 500 μL TMRE içeren ortamla değiştirin. Kalan kuyucuklarla birlikte iyice devam edin.
NOT: Hücrelerin kurumasına izin vermemeye ve hücreleri rahatsız etmemeye özen gösterin. - Hücreleri inkübatöre geri koyun ve boya dengesi için en az 60 dakika bekleyin.
NOT: Yükleme süresi, olumsuz etkiler olmaksızın birkaç saate kadar uzatılabilir. - Görüntüleme deneyi boyunca tutarlı TMRE konsantrasyonu ve dengelemesi sağlamak için, görüntüleme tamponuna ve tüm stimülasyon çözeltilerine 20 nM TMRE'lik bir nihai konsantrasyon eklediğinizden emin olun.
2. Taramalı konfokal mikroskop ayarlarının optimizasyonu
NOT: Bu adım, canlı görüntüleme sırasında görüntü kalitesi ile hücre canlılığı arasında en iyi uzlaşmayı bulmayı amaçlar. Bu bölümde, indirgeme oksidasyonuna duyarlı yeşil floresan protein (roGFP) görüntüleme ayarlarının optimizasyonu açıklanmaktadır. Multiparametrik görüntüleme yapılırsa, ek göstergeler için ağartma veya fototoksisite belirtileri olmadan stabil bir taban çizgisinin kontrol edilmesi de dahil olmak üzere benzer bir optimizasyonun yapılması gerekir.
- Konfokal mikroskobu başlatın ve GFP görüntüleme için standart ayarları yükleyin (488 nm uyarma, 505 - 550 nm emisyon).
- Dedektörü 12 bit veya 16 bit olarak ayarlayın. not: Genellikle, kantitatif görüntüleme için 8 bit yeterli değildir.
- Sıralı tarama modunu etkinleştirin ve ikinci sekans/parça ekleyin (405 nm uyarma, 505 - 550 nm emisyon).
- Her iki kanal için, fazla ve az pozlanmış pikselleri gösteren bir sahte renk arama tablosu seçin (ör. GLOW OU).
- İlgilenilen nesneye uygun bir hedef seçin.
NOT: 10x-40x tek hücreli analiz için uygundur, 63x-100x tek mitokondri analizi için uygundur. - Görüntüleme odasına hücreli bir lamel monte edin, 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskobun üzerine yerleştirin.
- Hücreleri odaklamak için göz merceğini ve iletilen ışığı kullanın.
NOT: Hücreleri bulmak ve odaklamak için epifloresan ışığı kullanmayın. Düşük güçte bile, bu hücreleri olumsuz yönde etkileyecektir. - Farklı piksel formatlarında görüntüler kaydedin. Bu görüntülere dayanarak, ilgilenilen yapının kabul edilebilir bir çözünürlüğünü veren en düşük piksel numarasını seçin.
NOT: Tipik olarak, 512 x 512 piksel, 20x ve 40x objektifli tek hücreli görüntüleme için iyi çalışır ve 1024 x 1024 veya 2048 x2048 piksel, 63x objektifli tek mitokondri görüntüleme için tipik olarak iyi çalışır. - Farklı iğne deliği boyutlarına sahip görüntüler kaydedin. Bu görüntülere dayanarak, ilgilenilen yapının kabul edilebilir bir çözünürlüğünü veren en büyük iğne deliği boyutunu seçin.
NOT: Tipik olarak, 3-7 havadar ünite iyi çalışır. - Farklı lazer yoğunluklarına sahip görüntüler kaydedin.
- Dedektör kazancını ve eşiğini buna göre ayarlayın. Bu görüntülere dayanarak, kabul edilebilir sinyal yoğunluğu ve sinyal-arka plan oranı sağlayan en düşük lazer yoğunluğunu seçin.
- Sinyal-arka plan oranını belirlemek için, hücreler veya mitokondri içeren bir ilgi alanındaki (ROI) (ROI1) ve hücre veya mitokondri içermeyen bir ROI'deki (ROI2) sinyal yoğunluğunu ölçün. Ardından, ROI1'in yoğunluğunu ROI2.NOT: %>3'lük bir sinyal-arka plan oranı ve %200,1,000 lazer gücü ile 405 nm uyarma için 1-3 bireysel ROI'lerin sinyal yoğunluklarını ve %300 lazer gücüyle 1,500 nm uyarma için 1-1,500 bireysel ROI'lerin yoğunluklarını hedefleyin.
- Farklı tarama hızlarına ve kare ortalamalarına sahip görüntüler kaydedin. Her ayar kombinasyonu için 4-5 görüntü kaydedin. Bu görüntü serilerine bağlı olarak, kabul edilebilir görüntü paraziti ve görüntüden görüntüye değişkenlik sağlayan en yüksek hızı ve en düşük ortalama ayarları seçin.
NOT: Ortalama almak için 600 Hz ve 1-2 kare tarama hızı çoğu durumda iyi sonuç verir. - Yeni bir lamel kullanarak, optimize edilmiş ayarlarla hızlandırılmış bir seri kaydedin.
NOT: Serinin süresi ve görüntü aralığı, planlanan deneylerinkine benzer olmalıdır. - Hızlandırılmış serinin sonunda, kayıt odasına 1 mL 2x Diamide (DA) solüsyonu ekleyin. Ek 2 dakika için görüntü.
- Peristaltik bir pompa veya el tipi pipet kullanarak görüntüleme arabelleğini aspire edin. 1 mL 1x Ditiyotreitol (DTT) çözeltisi ekleyin. Ek 5 dakika için görüntü.
- Hızlandırılmış deneyi analiz edin.
- Optimize edilmiş ayarlarla DA ve DTT tedavisi sırasında iki kanaldan hiçbirinin fazla veya az pozlanmadığını doğrulayın.
- Zaman atlamalı kayıt sırasında iki kanaldan hiçbirinin önemli ölçüde ağarma göstermediğinden emin olun; ilk ve son görüntüler arasında %<2 yoğunluk kaybı hedefleyin.
- Görüntüleme sırasında 405:488 oranının önemli ölçüde değişmediğini doğrulayın.
- Tutarlı bir şekilde kabul edilebilir sonuçlar sağlayan ayarlar tanımlanana kadar tüm prosedürü yinelemeli bir şekilde, birkaç lamel kullanarak tekrarlayın.
3. Bazal redoks durumunun değerlendirilmesi
- Mikroskobu başlatın ve bölüm 2'den optimize edilmiş ayarları yükleyin.
- Kare ortalamasını 3-5 olarak ayarlayın.
- Görüntüleme odasına hücreli bir lamel monte edin, 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskobun üzerine yerleştirin.
- Hücreleri odaklamak için göz merceğini ve iletilen ışığı kullanın.
NOT: Hücreleri bulmak ve odaklamak için epifloresan ışığı kullanmayın. Düşük güçte bile, bu hücreleri olumsuz yönde etkileyecektir. - Tarama moduna geçin ve görüntüleme için hücreleri odaklamak ve bulmak için canlı görüntüde 488 nm kanalını kullanın.
- Lamel üzerinde 3-5 görünüm alanı seçmek için çok noktalı işlevi kullanın.
- Bir temel görüntü kaydedin.
- Hazneye 1 mL 2x DA çözeltisi ekleyin.
- 1, 2 ve 3 dakika sonra, odağı onaylamak/ayarlamak için canlı görüntüyü kullanın ve ardından bir görüntü kaydedin.
NOT: Hücreler tipik olarak 2 dakika sonra tamamen oksitlenir. - Görüntüleme odasındaki tamponu 1 mL 1x DTT solüsyonu ile değiştirin.
- 3 ve 5 dakika sonra, odağı onaylamak/ayarlamak için canlı görüntüyü kullanın ve ardından bir görüntü kaydedin.
NOT: Hücreler genellikle 4-5 dakika sonra tamamen azalır.
4. Akut tedavilerin canlı görüntülenmesi
NOT: Aşağıdaki protokol, NMDA tedavisine mitokondriyal redoks yanıtının görüntülenmesini açıklamaktadır. Görüntü aralıklarının ve deneyin süresinin diğer tedaviler için ayarlanması gerekebilir.
- Mikroskobu başlatın ve 3. bölümden optimize edilmiş ayarları yükleyin.
- Hızlandırılmış çekim aralığını 30 saniyeye ve süreyi 25 dakikaya ayarlayın.
- Görüntüleme haznesine hücreli bir lamel monte edin, 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin ve hazneyi mikroskobun üzerine yerleştirin.
NOT: Termal odak kaymasını önlemek için, hızlandırılmış görüntülemeye başlamadan önce hücreleri 10-15 dakika mikroskop aşamasında bırakın. - Hücreleri odaklamak için göz merceğini ve iletilen ışığı kullanın.
NOT: Hücreleri bulmak ve odaklamak için epifloresan ışığı kullanmayın. Düşük güçte bile, bu hücreleri olumsuz yönde etkileyecektir. - Tarama moduna geçin ve görüntüleme için hücreleri odaklamak ve bulmak için canlı görüntüde 488 nm kanalını kullanın.
- İsteğe bağlı: Çalışma başına kaydedilen hücre sayısını artırmak için, lamel başına 2-3 görüş alanı görüntülemek için çok noktalı işlevi kullanın.
- Zaman atlamalı çekimi başlatın ve 5 görüntüyü 2 dakikalık temel kayıt olarak kaydedin.
- Odaya 500 μL 3x NMDA çözeltisi ekleyin (nihai konsantrasyon 30 μM) ve 10 dakikalık bir NMDA yanıtı olarak ek 20 görüntü kaydedin.
NOT: Nöronlar ozmolaritedeki değişikliklere karşı çok hassastır. Bu nedenle, görüntüleme arabelleğinin buharlaşmasını en aza indirdiğinizden emin olun. Daha uzun tedaviler için görüntüleme odası bir kapakla kapatılmalıdır. - Hazneye 500 μL 4x DA solüsyonu ekleyin ve 6 görüntü daha kaydedin (3 dk maksimum kalibrasyon).
- Tamponu görüntüleme odasından aspire edin ve 1 mL 1x DTT solüsyonu ile değiştirin. 10 görüntü daha kaydedin (minimum 5 dakika kalibrasyon).
- Kaydı sonlandırın ve görüntü serisini kaydedin.