Kuvars mikroiğne kullanılarak kemirgen beyin mikroenjeksiyonu

Özet

Kaynak: Paolone, G., et al. Kemirgen beynine mikroenjeksiyonlar için kişiselleştirilmiş iğneler. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, delikli bir kuvars mikroiğne kullanılarak yapılan bir kemirgen beyin mikroiğne enjeksiyonunu göstermektedir. Mikroiğne, teslimat hızını kontrol etmek için bir şırıngaya ve mikro pompaya bağlanır. Enjeksiyon solüsyonu ile iğne, iletim hızı düşük olarak ayarlanmış olarak beyne yerleştirilir. Konumlandırıldıktan sonra teslimat hızı artırılır. Kısa bir duraklamadan sonra iğne geri çekilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Kuvars İğnelerinin Hazırlanması

1. Kuvars kılcal damarları (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 dakika damıtılmış suda, 5 dakika etanolde %99 ve 5 dakika dietil-eter içinde yerleştirerek temizleyin ve sterilize edin.
2. Kılcal damarları tamamen kuruması için en az 1 saat kaputun altında bırakın.
3. Bireysel ihtiyaçlara bağlı olarak, yeterince uzun, yeterince ince bir iğne üretilmesine izin veren parametrelere göre bir lazer çektirme kullanarak iğneleri hazırlayın.
   NOT: Bir lazer çektirme kullanıyoruz (Malzeme Tablosuna bakın). Çekmek için iki satırlı bir program kullanın. İlk satır yüksek güç, en büyük tarama uzunluğu (FİLAMANIN DEĞERİ'ne karşılık gelir) kullanır ve çekme kuvveti kullanmaz. Bu parametre kombinasyonu, kılcal damarın en büyük kısmının en düşük uzatma hızıyla erimesine yol açarak, büyük bir iç/dış boyuta ve küçültülmüş şafta sahip uzun bir iğnenin şekillendirilmesine olanak tanır. Bu sayede iğne, kök hücrelerin veya viral partiküllerin tıkanmadan geçişine izin veren yüksek bir mekanik direnci ve geniş bir iç çapı korur. Bu program çizgisinin hızı ve gecikmesi, uç çok küçük ve uzun hale gelmeden, gerekli mekanik ve şekil özelliklerini kaçırmadan önce kılcal uzamayı durdurmalıdır. Çekme programının ikinci hattı, kuvars soğuduğunda (5 s) otomatik olarak yürütülür. Güç, filament ve çekme kuvveti parametreleri, mümkün olan en kısa uç uzunluğuna ve dik sapa sahip bir ucu kesmek için işlevseldir ve iki iğnenin bir uç kopması ile ayrılmasını önler. Rutin olarak, ekipmanlarımızla aşağıdakileri kullanırız: (a) Hat 1 = güç 990, filament 5, hız 130, gecikme 110, çekme 0; (b) Hat 2 = güç 970, filament 3, hız 0, gecikme 70, çekme 0.
4. İğneleri daha önce% 70 etanol ile temizlenmiş bir Petri kabına koyun.
   1. Tabağı plastik bir parafin filmle örtün.
5. Mikro disektör ile kılcal damarları kesin.
   1. Başlangıçta, lazerin sağlanan güç ve enerjiyi doğrulamak için bir otomatik kalibrasyon işlemi çalıştırmasına izin verin. Ardından, kesme parametrelerini ayarlayın.
      NOT: Bir mikro disektör (Malzeme Tablosuna bakın) ve aşağıdaki parametreleri kullanıyoruz: lazer gücü darbe enerjisi (63 μJ), maksimum açıklığın %20'si kadar lazer ışını çapı (maksimum diyafram: 1,0 μm) ve maksimum hızın %10'u kadar kesme hızı (maksimum hız: 30 μm/s).
   2. İğneyi mikroskop tablasına sıkıca sabitleyin ve ucunu bilgisayar ekranının ortasına yerleştirin.
   3. Menü çubuğunda kalem simgesine tıklayın ve iğnenin lazerle kesilmesi için bir işaret çizmek için kullanın.
      NOT: Kesim, iğne yüzeyine göre yaklaşık 45°'lik bir açıda olmalıdır.
   4. Kenar çubuğu işlevinde, lazerin daha önce işaretlenmiş noktayı kesmesine izin vermek için "CUT START" düğmesini içeren bayrağı seçin.
   5. Gerekirse, 1.5.2-3'te açıklanan prosedürleri tekrarlayarak yan delikleri kesin; iğneyi yeniden konumlandırmaya gerek yoktur (Şekil 1).
6. Kesim sonrası temizlik.
   1. İğneyi plastik bir tüp aracılığıyla bir boşluk pompasına bağlayın.
   2. Pompayı açın ve ileri akış hızını manuel olarak orta bir hızda (3 μL/dak) ayarlayın.
   3. Kesmeden kaynaklanan safsızlıkları gidermek için önce %99 etanolü ve ardından damıtılmış suyu aspire edin.
   4. Kurumayı kolaylaştırmak için %99 etanolü tekrar aspire edin.
      NOT: Her adım en az 3 dakika sürmelidir.
7. İğneleri ameliyat gününe kadar uygun şekilde kapalı bir Petri kabında saklayın.
8. İğneler tekrar kullanılabilir; deneyin sonunda, çözeltiyi ve olası doku kalıntısını gidermek için çamaşır suyu ve etanol ile temizleyin. Daha eksiksiz bir temizlik için, iğneleri ucu aşağı bakacak şekilde bir mikropipet saklama kavanozuna koyun, kavanozu uçları kapanana kadar damıtılmış suyla doldurun, kalan dokuyu çıkarmak için 1,5 dakika kaynatın, ardından etanol ile yıkayın.

2. Prosedür

1. Pompa kullanım kılavuzunda verilen talimatlara uygun olarak, mikroenjeksiyon şırıngasının çapına/hacmine göre pompayı kalibre etmek için ayarlar menüsünü seçin ve akış hızını 0,3 μL/dk olarak ayarlayın.
2. Künt bir iğne (örneğin, Hamilton iğnesi, 30 G) ve kısa bir politetrafloroetilen tüp ile donatılmış 10 mL'lik bir şırıngayı steril suyla doldurun ve mikroenjeksiyon şırıngasını doldurmak için kullanın (pistonu çok dikkatli bir şekilde çıkardıktan sonra) ve manuel mikroenjeksiyon pompası (MMP) için enjeksiyon tertibatı parçaları kitini kullanın.
   NOT: MMP kiti, iğneyi stereotaktik çerçeveye güvenli bir şekilde monte etmek için kullanılır (Şekil 2). Kit, bir politetrafloroetilen boru, bir luer-to-tüp kuplörü, bir pipet tutucu ve farklı dış çaplara sahip pipetler için contalar içerir.
3. İğneyi MMP kitine bağlayın.
   1. 10 mL'lik şırınga ile sistem boyunca daha fazla su akıtın ve suyun iğneden çıkıp çıkmadığını kontrol edin.
      NOT: Doldurma adımlarını tekrarlayarak sistem içindeki hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun.
4. Mikroenjeksiyon şırıngasının üst kısmında bir damla su bırakmak için pistonu yavaşça iterken 10 mL'lik şırıngayı mikroenjeksiyon şırıngasından ayırın. Pistonu mikroenjeksiyon şırıngasına yerleştirin.
5. Mikroenjeksiyon şırıngasını pompaya bağlayın ve akış hızını 0,3 μL/dk.
   olarak ayarlayın: NOT: İğnenin ucundan bir damla sızana kadar bekleyin ve ardından 3 dakika daha bırakın.
6. Akışı 0,1 μL/dk'ya ayarlayın ve cerrahi prosedürü başlatın. Ameliyat yapılırken pompa çalışıyor olmalıdır.
   NOT: Bu makalede bildirilen deneyler için 300 g (3 aylık) erkek Sprague Dawley sıçanları kullanıyoruz. Bununla birlikte, prosedür diğer türlere, özellikle farelere uygulanabilir.
7. Yerel yönetmelikler tarafından onaylanmış bir yöntem kullanarak genel anesteziyi indükleyin.
   NOT: 20-50 dakikalık anestezi için 85 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin intraperitoneal enjeksiyon (ip) karışımı kullanıyoruz. Hayvanın tamamen sakinleşmesini sağlamak için kuyruk ve/veya ayak parmağı tutamlarının kullanılması önemlidir. Anestezi seviyesi ve temel hayati değerler ameliyat başlamadan önce değerlendirilir ve ameliyat yapılırken her 10 dakikada bir izlenir. Hayvan vücut ısısı, su sirkülasyonlu bir ısıtma yastığı kullanılarak cerrahi prosedürler öncesinde, sırasında ve sonrasında sabit tutulur. Hayvanlar tamamen iyileşene kadar izlenir (örneğin, dik ve ayaktadırlar). Ek olarak, hayvanlara ameliyat sonrası üç gün boyunca her 24 saatte bir analjezikler (tramadol, 5-7 mg / kg ip) verilir.
   1. Hayvanın kafasını tıraş edin ve ameliyat bölgesini aseptik cerrahi için yeterince hazırlayın. İyot bazlı çözelti (Betadine) ve ardından %70 etanol ile iki aşamalı bir fırçalama yapın. Ayrıca, asepsisi korumak için cerrahi bölgeyi cerrahi bir örtü ile sarın (videoda gösteri amacıyla atlanmıştır).
8. Fareyi stereotaksik çerçeveye, su sirkülasyonlu bir ısıtma battaniyesinin üzerine yerleştirin. Ek ağrı kesici sağlamak için, ameliyat bölgesinde% 0.5 lidokain çözeltisi uygulayın (7 mg / kg'ı aşmayın). Ekipmanı %2 glutaraldehit artı %7.05 fenol (Sporodicin veya Cidex) içine daldırarak ve ardından steril su veya tuzlu su ile durulayarak tüm cerrahi aletleri bir boncuk sterilizatörü veya sıvı soğuk dezenfeksiyon kullanarak önceden sterilize edin. Dezenfeksiyon, prosedürler arasında bile yapılmalıdır. Sterilize edilmiş bir neşter kullanarak kafatası üzerinde uzunlamasına bir kesim yapın. Aşırı kanamayı önlemek için nazik olun. Düz bir spatula kullanarak kafa derisini açın ve açık tutmak için cilt kanatlarına cerrahi klipsler uygulayın. Çok nazikçe, bregmayı ve iğnenin sokulacağı kafatası bölgesini ortaya çıkarmak için periosteuumu ayırın.
9. Kolu stereotaksik çerçeveye monte edin (akış devam ederken) ve iğnenin ucunu tam olarak bregma'nın üzerine getirin, ucunu kırmamaya dikkat edin. Bregmanın antero-posterior ve medio-lateral koordinatlarını açıklama ekleyin ve istenen koordinatlara çevirin. Bir stereomikroskop tarafından yönlendirilen iğneyi, ucu neredeyse kafatasına değene kadar indirin, stereotaksik kolu biraz kaldırdıktan sonra delme noktasını işaretleyin.
10. Kafatasını işaretli noktada delin (matkap ucu Ø: 0,8 mm; delme hızı: 1.000 rpm). Delme işlemleri sırasında duraya nüfuz etmemeye özen gösterilmelidir. Delme sırasında, kemik hasarını ve nekrozu önlemek için steril tuzlu su damlatın.
11. Küçük bir parça plastik parafin filmi kesin ve kafatasının üzerine yerleştirin. 10 μL'lik pipeti kullanarak, plastik parafin filmine enjekte etmek için solüsyondan bir damla damlatın. Pompayı durdurun, pompanın iticisini hafifçe geri çekin ve mikroenjeksiyon şırıngasının pistonunu hafifçe çekerek kılcal damarda küçük bir hava kabarcığı oluşturun.
12. İğnenin ucu damlaya ulaşana kadar stereotaktik kolu indirin. Herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için mikroenjeksiyon şırıngasının pistonunu çekerek (çok yavaş) numuneyi çizin. Pistonla temas eden pompa iticisini değiştirin ve pompayı 0.3 μL/dk akış hızında açın. Bir sonraki adıma geçmeden önce bir damla oluşumunu bekleyin (birkaç dakika).
    NOT: Mevcut örnek deneyde, striatuma yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) infüze edildi [AP (Anteroposterior): +1.5, ML (Mediolateral): ±2.7; DV (Dorsoventral): -5.0] ve dorsal hipokampusta (AP: -3.5, ML: ±2.1; DV: -3.5; dura'dan mm cinsinden), 2 μL/site. İki enjeksiyon yöntemi arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için, her bir beyin bölgesi, bir yarım kürede bir kuvars iğnesi ve diğerinde 26 G künt uç veya 30 G konik uçlu paslanmaz çelik iğne kullanılarak infüze edildi.
13. Akışı 0.1 μL / dk'ya düşürün, durayı paslanmaz çelik konik uçlu bir iğne ile çentikleyin ve dorso-ventral balta üzerindeki stereotaktik kolu yavaşça indirerek beyin dokusuna girin. İstenilen konuma ulaşıldığında, 0,1 mm daha aşağı inin, pompayı durdurun, stereotaktik kolu 0,1 mm kaldırın ve pompayı akışta 0,3 μL/dk.NOT: İğneyi indirirken yavaş bir akışın korunmasının nedeni, iğnenin kendisindeki küçük doku parçalarının nüfuz etmesini önleyen pozitif bir basınç sağlamaktır. Böyle bir olay, çözeltinin teslimini bozarak ucu engeller. İğneyi indirirken akış hızı çok yavaş olduğundan ve indirme hızı yaklaşık 10 s/mm olduğundan, bu, iğne yolu boyunca kalan çözelti miktarlarının hedef bölgeye enjekte edilenlere kıyasla ihmal edilebilir olduğu anlamına gelir. Yan delikli iğneler kullanılırken bu önlemden kaçınılabilir.
14. Zamanlayıcıyı başlatın ve enjekte etmek için istenen hacme bağlı olarak gereken süreyi bekleyin (örneğin, 2 μL enjekte ediliyorsa 6 dakika 40 s). Enjeksiyon sırasında kabarcık hareketini izleyin. Sonunda, pompayı durdurun ve iğneyi yavaşça almadan önce 5 dakika bekleyin. Kuvars iğnesi tamamen çekildiğinde, pompayı tekrar çalıştırın ve iğnenin ucunda bir damla oluşup oluşmadığını kontrol edin.
15. Kafatası yüzeyindeki açıklığı kemik mumu ile kapatın, hemostatik klipsleri çıkarın ve kafa derisini dikin, yaranın etrafındaki alanı bir antibiyotik kremle kaplayın (ör., neosporin) ve hayvanı ev kafesine geri koyun.

Sonuçlar

Şekil 1: Bir kuvars iğne ucunun, ucun farklı çaplarını ve sıvıların enjeksiyonu için kullanılan delikleri gösteren mikroskobik görüntüsü. (A)'da düşük büyütmeli resim ve (B) ve (C)'de daha yüksek büyütme. İğne, (B) ve (C)'de gösterildiği gibi ...

Malzemeler