İmmün Etiketli Astrositlerin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Hayvanlar, Cerrahi ve Numune Hazırlıkları

NOT: Beyin dokusunu üç boyutlu (3D) konfokal mikroskobik analiz için hazırlayın.

1. Hayvanları rastgele iki gruba ayırın: amiloid beta (Aβ) _1-40 enjeksiyonu (n = 8) ve genistein tedavisi ile Aβ_1-40 enjeksiyonu (n = 8); ameliyattan 1 saat önce gavaj ile genistein (polietoksillenmiş hint yağı gibi bir araçta seyreltilmiş 10 mg / kg) uygulayın.
2. Hayvanları ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) ile uyuşturun. Ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra geri çekilme refleksi eksikliği ile uygun anesteziyi onaylayın. Kuruluğu önlemek için ameliyat sırasında gözlere merhem kullanın.
3. Hayvanları stereotaksik aparata yerleştirin ve kafayı tıraş edin. Kesiden önce kafa derisini temizlemek için iyot solüsyonu uygulayın ve enfeksiyon riskini azaltmak için ameliyat sırasında ameliyat bölgesini steril tutun. Sıçan beyin atlasına göre, hipokampusta bregmanın -3.5 mm arkasında, orta hatta ± 2 mm lateral ve duranın -2.8 mm altında hipokampusta Aβ_1-40 stereotaksik olarak (4 μl) enjekte edin.
4. Hayvanların rahatını sağlamak için hayvanlar tamamen bilinçli olana kadar ameliyat sonrası gözlem/bakım sağlayın. İyileşme sırasında hayvanları sıcak tutun ve tamamen iyileşene kadar onları diğer hayvanlarla birlikte bir kafese geri koymayın. Ameliyattan sonra hayvanlarda herhangi bir enfeksiyon belirtisine dikkat edin.
5. Ameliyattan üç hafta sonra hayvanları ketamin (150 mg / kg) ile derinlemesine uyuşturun. Hayvanları %0.9 salin ve ardından 0.1 M Fosfat tampon salin veya PBS (pH = 7.4) içinde %4 paraformaldehit ile perfüze ederek transkardiyal fiksasyon gerçekleştirin, ardından beyni çıkarın ve sabitleyin.
6. Beyinleri 4 ° C'de 2-3 gün boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
7. Doku gömme ekipmanı kullanarak dokuyu parafin bloklarına gömün ve doğru hizalama veya kesitlemeyi engelleyebileceğinden kaseti yetersiz veya fazla doldurmaktan kaçının. Parafin bloğundaki dokunun oryantasyonuna dikkat edin.
   NOT: Örneğin sıçan hipokampusu, serebral hemisferin arka kısmına yakındır. Bu nedenle doku, beynin arka kısmından kesit başlayacak şekilde gömülmelidir. İstenilen anatomik yapıya ulaşmak için Paxinos atlasını kılavuz olarak kullanın.
8. Mikrotomu hava akımlarından veya kapılardan uzağa yerleştirin, çünkü hava hareketleri bölümlerin kullanımını zorlaştırır.
9. ≥20 μm kalınlığa sahip bölümler kullanın, çünkü bu derinlik tam astrositlerin Z-Stack görüntülerini üretmek için gerekli olacaktır. Termal genleşme nedeniyle istenmeyen kalınlığa sahip olabileceğinden ilk birkaç bölümü kullanmayın.
10. Bölümleri düzleştirecek kadar uzun süre ılık su yüzeyine (5 ± 2 °C, parafin için erime sıcaklığının altında) yerleştirin.
    NOT: Bölümün aşırı genişlemesi yapının morfolojisini bozabilir. Bölümleri dikkatlice aktarmak için küçük bir boya fırçası kullanın. Her slaytta iki ila üç bölüm toplayın.
11. Slaytları dik bir rafta saklayın ve 37 °C'de birkaç saat veya gece boyunca (O/H) kurumaya bırakın.

2. İmmünohistokimya

1. Ksilendeki kesitleri 2 x 10 dakika deparafinize edin ve alkol gradyanı (% 99.8,% 95 ve% 70, her biri 10 dakika) ve PBS ile rehidrat.
2. % 0.25 sığır serum albümini (BSA),% 0.25 Triton X-100 ve% 3.5 normal serum (4 ° C'de O / N) içeren PBS'de 1: 1.500 seyreltilmiş glial fibriler asidik proteine (GFAP) karşı antikorlarla inkübe edin.
3. Bölümleri PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
4. İkincil alkalin fosfat konjuge antikorlarla 1 saat (1:100, 21°C, PBS'de seyreltilmiş) inkübe edin.
5. Bölümleri PBS'de 3 x 5 dakika boyunca yıkayın.
   NOT: Arka plan lekelenmesini en aza indirmek için ikincil antikorlardan sonra bölümleri uygun şekilde yıkamak önemlidir.
6. Sıvı Kalıcı Kırmızı Kromojen (15-20 dakika) ile karanlıkta bölümleri inkübe edin.
   Not: Solüsyonu kullanmadan en fazla 30 dakika önce hazırlayın.
7. Bölümleri PBS'de 3 x 5 dakika yıkayın.
8. Son olarak, kapak kaymadan önce çekirdeği 4-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1:500, PBS'de seyreltilmiş) ile boyayın. Mikroskopiden önce slaytları 24-48 saat buzdolabında saklayın.

3. Konfokal Mikroskopi

NOT: Kantitatif değerlendirme için (aşağıya bakınız), hata riskini azaltmak için minimum örtüşen dallara sahip, açıkça görülebilen DAPI lekeli bir çekirdeğe sahip bir astrosit seçin. Z-Stack görüntülerinin üretilmesi zaman alıcıdır. Sabırlı olun ve işlem sırasında durmayın. Astrositlerin 3D görüntülerini oluşturmak için dik bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılır.

1. Slaytı mikroskop tablasına koyun ve 63X objektifi seçin.
2. Görüntüleme yazılımını açın ve Sistemi Başlat'a tıklayın. Bul sekmesine tıklayın. Ata'ya gidin ve uygun ışığı ayarlamak için GFP'yi seçin.
3. Işığı yansıtmak için Deklanşörü açın. Deklanşörün sağ tarafındaki Reflektör Tabancasını bulun ve astrositler tarafından yansıtılması gereken rengi (yeşil, kırmızı veya mor) seçin; burada kırmızı renk (FSet20 wf) kullanılmıştır.
   NOT: Resmi doğrudan mikroskobun oküler cihazına odaklamayı unutmayın.
4. En iyi odağı bulmak için Tümü Kapalı'ya tıklayın, mikroskop pimini ekran moduna getirin ve Edinme sekmesine tıklayın.
5. Edinme sekmesi altındaki Akıllı Kurulum'a tıklayın; bir pencere açılır. Listeden uygun floroforu (yani mevcut projede DAPI ve Alexa Fluor 555) seçin. Renk otomatik olarak seçilir.
6. En İyi Sinyal ve Uygula'ya tıklayın, ardından Pozlamayı Ayarla'ya tıklayın; bilgisayar daha sonra pozlama parametrelerini otomatik olarak ayarlayacaktır.
7. Görüntüyü optimize etmek için Kanallar penceresine gidin. Track2'nin işaretini kaldırın, Track1'i vurgulayın ve Canlı'ya tıklayın. Gerekirse görüntüye odaklanın.
8. Kanallar penceresinde aşağıdaki tuşları ayarlayın; iğne deliğini otomatik olarak optimize etmek için 1AU'ya tıklayın. Bu adımı yapmak çok önemlidir, aksi takdirde konfokal görüntüler optimal olmayacaktır. Kazancı en iyi yoğunluğa sahip olacak şekilde ayarlayın (ekstra gürültüyü azaltmak için bu ayarı 800'ün altında tutun). Son olarak, Dijital Kazancı 2 ile 3 arasında ayarlayın.
9. Parça1'in işaretini kaldırın, Parça2'ye tıklayın ve Parça3.8 için Adım 2'i tekrarlayın. Ardından Canlı Yayın'ı durdurun.
10. Edinme Modu penceresine gidin. Çerçeve Boyutunu ve Ortalamayı optimize ederek görüntüyü iyileştirin. Çerçeve boyutunu değiştirmek için X*Y'ye gidin ve 1.024 x 1.024'ü seçin. Daha iyi bir görüntü oluşturmak için yavaş bir Hız seçin.
11. Ortalama'ya gidin ve bir Sayı ≥4 seçin. Bu ortalama değeri, elde edilen görüntüyü oluşturmak için ortalaması alınacak tarama sayısını gösterir. Şimdi, Snap düğmesine tıklayın ve yakalanan 2D görüntüyü kaydedin.
12. 3D görüntüleme için, Akıllı Kurulum altındaki Z-Stack öğesini işaretleyin ve Z-Stack penceresinin açılmasını sağlayın.
13. Z-Stack için ilk ve son konumları, yani hücrenin derinliğini ayarlayın. İlk olarak, Canlı'ya tıklayın. Ardından, Z-Stack'in başlayacağı dokudaki astrositin en üst konumuna odaklanmak için mikroskobun odak sürücüsünü kullanın. Önce Ayarla'ya tıklayın. Ardından, Z-Stack taramasının durdurulması gereken dokudaki astrositin en alt konumuna odaklanın. Son Ayarla'ya tıklayın. Ardından Canlı Yayın'ı durdurun.
14. Aralığı seçin; mevcut çalışmada 1.01 μm kullanılır; dilim sayısını ayarlamak için Optimal'e tıklanarak aralık seçimi yapılabilir.
15. Denemeyi Başlat'a tıklayın. Tarama tamamlandıktan sonra görüntüleri kaydedin. Bu görüntü, aşağıdaki parametrelerin ölçümü için kullanılacaktır: astrosit bölgesinin yüzey alanı ve hacmi ile dallar, hücre gövdesi ve çekirdek dahil olmak üzere tüm astrosit.